Artigo de método

Medição quantitativa de invadopodia mediada proteólise da matriz extracelular em Contextos individuais e multicelulares

DOI:

10.3791/4119

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27 de agosto de 2012

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1Department of Neurobiology and Anatomy, Program in Cancer Cell Biology, Mary Babb Randolph Cancer Center, West Virginia University

Neste artigo

Resumo

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Descreve-se o método para a produção de prototípico lamelas de microscópio revestidas com gelatina de fluorescência para visualização invadopodia mediada por degradação da matriz. Técnicas computacionais utilizando software disponível são apresentados para quantificar os níveis resultantes de proteólise da matriz por células individuais dentro de uma população mista e para os grupos que abrangem todo multicelulares campos microscópicos.

Resumo

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Invasão celular em tecidos locais é um processo importante no desenvolvimento e homeostase. Invasão Malregulated e movimento subsequente é característica de células de vários processos patológicos, incluindo a inflamação, doença cardiovascular e metástases de células do tumor 1. Degradação proteolítica focalizado de matriz extracelular (ECM) em componentes da membrana basal epitelial e endotelial, é um passo crítico na iniciação invasão celular. Em células tumorais, extensa análise in vitro determinou que a degradação de ECM é realizado por ventrais estruturas ricas em actina de membrana denominado protrusivos invadopodia 2,3. Invadopodia forma em aposição próxima da ECM, onde moderada avaria ECM através da acção de metaloproteinases de matriz (MMPs). A capacidade das células tumorais para formar invadopodia correlaciona-se directamente com a capacidade de invadir a estroma local e associados componentes vasculares 3. _content "> A visualização das invadopodia degradação mediada por ECM de células por microscopia de fluorescência usando proteínas marcadas com corante de matriz revestida em vidro lamelas tem emergido como a técnica mais comum para avaliar o grau de proteólise da matriz e do potencial invasivo celular 4,5. Aqui descrevemos uma versão do método padrão para a geração de lamelas de vidro marcados por fluorescência utilizando um equipamento comercialmente disponível Oregon Green-488 conjugado gelatina. Este método pode ser facilmente dimensionada para produzir rapidamente um grande número de lamelas revestidas. Mostramos alguns dos erros comuns microscópicas que são frequentemente encontrados durante este processo, e como estes podem ser evitados. Finalmente, descrevemos métodos normalizados, utilizando software de computador facilmente disponível para permitir a quantificação da degradação da matriz de gelatina marcada mediada por células individuais e por toda a populações celulares. Os procedimentos descritos proporcionam a capacidade de controlar de forma precisa e reprodutível invadopodiaactividade, e pode também servir como uma plataforma para a avaliação da eficácia da expressão da proteína de modulação ou ensaio de anti-invasivos compostos sobre a degradação da matriz extracelular em locais individuais e multicelulares.

Protocolo

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1. Produção de Oregon Verde 488-Lamelas revestidas de gelatina

  1. Prepara-se uma 5% não marcado (w / w) estoque gelatina / solução de sacarose através da adição de 1,25 g de gelatina e 1,25 g de sacarose em PBS a um volume final de 50 ml. Aquecer a solução de gelatina a 37 ° C e garantir que ele é totalmente fundido antes da utilização. Armazenar a mistura final, a 4 ° C.
  2. Limpar diâmetro de 13 mm # 1 em lamelas de vidro de colocar uma lamela individual em cada poço de uma placa de cultura de tecido de plástico de 24 poços. Adicionar 500 ul de 20% de ácido nítrico a cada poço e incubar durante 30 min. Aspirar a solução de ácido nítrico e lavar lamela....

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Discussão

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A habilidade de visualizar as células que degradam a matriz extracelular ajudou na descoberta dos mecanismos moleculares utilizados nos passos iniciais da invasão celular. Lançado pela Wen-Tien Chen no início dos anos 1980 4,14,15, revestimento fluorescente etiquetado proteínas extracelulares em lamínulas para posterior análise microscópica emergiu como a principal técnica para avaliação da função invadopodia em uma ampla gama de tipos de células. O protocolo prescrito demonstra o método básico utilizado para.......

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por fundos de doações da West Virginia University Maria Babb Randolph Cancer Center. Agradecemos Susette Mueller (Georgetown University) e Laura Kelley para aconselhamento precoce e assistência. O uso da Universidade de West Virginia Facilidade imagens de microscopia (apoiado pela Babb Mary Randolph Cancer Center e, subvenções NIH P20 RR16440, P30 e P30 RR032138 GM103488) é reconhecido agradecimento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente / Instrumento Companhia Número de Catálogo Comentários
gelatina Sigma G1890 Pele de porco
sacarose Pescador BP220
12 milímetros lamínulas Pescador 50-121-5159
Placas de 24 poços Pescador 08-772-1 BD Falcon
ácido nítrico Ricca R5326000 Solução a 20%
poli-L-lisina Electron Microscopy Sciences 19320-B Solução a 0,1%
glutaraldeído Sigma G7526 Solução a 8%
Oregon Verde 488-conjugado gelatina Invitrogen G-13186
boro-hidreto de sódio Sigma 213462
Triton X-100 Pescador BP151
rodamina-faloidina Invitrogen R415
anti-cortactina (clone 4F11) Millipore 05-180
Anticorpo anti-FLAG Millipore MAB3118
Alexa Fluor 647 de cabra anti-IgG de ratinho Invitrogen A21235
Prolongar Antifade Ouro Invitrogen P36930
LSM 510 microscópio confocal Zeiss
ImageJ software Domínio público http://www.macbiophotonics.ca/imagej/
Software X2.2 Autoquant Media Cybernetics
NIS Elements software Nikon

Referências

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  1. Ridley, A. J. Life at the leading edge. Cell. 145, 1012-1022 (2011).
  2. Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
  3. Linder,....

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