Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca mitocôndrias 2 + Manuseamento, volume potencial de membrana mitocondrial e mitocondrial. O procedimento para a obtenção de coração e de alta qualidade funcional a mitocôndria é também descrito.
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Artigo de método
Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
A poro de transição da permeabilidade mitocondrial (mtPTP) é um canal não específico em que se forma a membrana mitocondrial interna para transportar solutos com uma massa molecular inferior a 1,5 kDa. Embora a identidade molecular definitivo do poro está ainda sob debate, proteínas tais como a ciclofilina D, e VDAC ANT contribuir para mtPTP formação. Embora a participação de abertura mtPTP na morte celular está bem estabelecido 1, acumulação de provas indica que o mtPTP serve uma função fisiológica durante mitocondrial homeostase Ca 2 + 2, bioenergética e redox sinalização 3.
mtPTP abertura é desencadeada pela matriz de Ca 2 +, mas a sua actividade podem ser moduladas por vários outros factores, tais como o stress oxidativo, o esgotamento de nucleótidos de adenina, altas concentrações de Pi, a despolarização da membrana mitocondrial ou desacoplamento, e os ácidos gordos de cadeia longa 4. In vitro, mtPTP de abertura pode ser achieved por aumento da concentração de Ca + 2 no interior da matriz mitocondrial através da adição exógena de Ca 2 + (capacidade de retenção de cálcio). Quando os níveis de Ca 2 + no interior mitocôndrias atingir um determinado limite, o mtPTP abre e facilita a libertação de Ca2 +, a dissipação de força motriz de protões, colapso potencial de membrana e um aumento de volume da matriz mitocondrial (inchaço) que em última análise conduz à ruptura da membrana mitocondrial externa e perda irreversível da função organela.
Descrevemos aqui um ensaio fluorométrico, que permite para uma caracterização completa de mtPTP abertura de coração de rato isolado mitocôndrias. O teste envolve a medição simultânea de 3 parâmetros mitocondriais que são alteradas quando a abertura mtPTP ocorre: mitochondrial Ca 2 + manuseamento (absorção e libertação, conforme medido por Ca 2 + a concentração no meio de ensaio), o potencial de membrana mitocondrial, e mitochovolume de ndrial. Os corantes utilizados para o Ca 2 + medida no meio de ensaio e o potencial de membrana mitocondrial são Fura FF, um impermeante de membrana, o indicador de medida proporcional que sofre uma mudança no comprimento de onda de excitação na presença de +, e JC-1, uma catiónica Ca 2, indicador de medida proporcional que forma monómeros verdes ou agregados vermelhas no potencial de membrana de baixa e alta, respectivamente. As variações de volume mitocondrial são medidos através da gravação de dispersão da luz pela suspensão mitocondrial. Desde de alta qualidade, as mitocôndrias funcionais são necessárias para o ensaio de abertura mtPTP, também descrever os passos necessários para obter intacta, coração altamente acopladas e funcional mitocôndrias isoladas.
Protocolo
1. Isolamento de mitocôndrias de coração rato
- Para isolar mitocôndria cardíaca, anestesiar e sacrificar animais de acordo com os procedimentos aprovados pelo seu Animal Care Institucional e Comitê local de uso.
Nota: Todos os passos do protocolo de isolamento de mitocôndrias deve ser executada em gelo. Use tampões de gelo frios e pratos pré-refrigerados de Petri, Falcon tubos e tubos Eppendorf. Os volumes indicados no protocolo são para uma amostra contendo 2 corações de rato.
- Remover os corações, colocá-los em tampão de isolamento frio Mitocôndria (300 mM de sacarose, 10 m....
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Discussão
O protocolo aqui apresentado descreve os passos necessários experimentais para avaliar a permeabilidade da abertura do poro de transição no coração mitocôndrias isoladas (Figura 1 e Figura 4): o procedimento para o isolamento de coração de rato mitocôndrias, os controles respiratórias que assegurem a sua integridade e funcionalidade, os parâmetros monitorizados durante mitocondriais mtPTP abertura e os corantes utilizados para a sua medição, a criação da instrumentação espectrofluoromét.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por HL094536 (BJH).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T3030 | |
| Inibidor de tripsina (soja) | Sigma-Aldrich | T9128 | |
| Hidrossulfito de sódio | Sigma-Aldrich | 71699 | |
| Rotenona | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Alameticina | Sigma-Aldrich | A4665 | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| A ciclosporina A | Calbiochem | 239835 | |
| Fura FF | Invitrogen | F14180 | |
| JC-1 | Invitrogen | T3168 | |
| Moinho de tecidos Potter-Elvehjem com um pilão de teflon de 15 ml | Wheaton Industries | ||
| Agitador suspenso | Wheaton Industries | 903475 | |
| Oxytherm (temperatura do eléctrodo de oxigénio controlado) | Hansatech Instruments | ||
| QuantaMaster 80 espectrofluorímetro emissão dupla | Photon Technology International, Inc. |
Referências
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial Membrane Permeabilization in Cell Death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Elrod, J., Wong, R., Mishra, S., Vagnozzi, R. J., Sakthievel, B., Goonasekera, S. A., Karch, J., Gabel, S., Farber, J., Force, T., Brown, J. H., Murphy, E., Molkentin, J. D.
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Reimpressões e permissões
