Profiling abrangente do Regulamento dopamina em substância negra e área tegmental ventral

Resumo

A dopamina é distintamente regulada nos núcleos mesencéfalo, que contêm a célula corpos e dendrites de os neurónios de dopamina. Descrevemos aqui uma abordagem dissecção e manipulação da amostra para maximizar os resultados, e, assim, conclusões e compreensão, na regulação da dopamina nos núcleos mesencéfalo da substantia nigra (SN) e área tegmental ventral (VTA) em roedores.

Resumo

A dopamina é um neurotransmissor vigorosamente estudada no SNC. Na verdade, o seu envolvimento na atividade locomotora e recompensa comportamentos relacionados promoveu cinco décadas de investigação sobre as deficiências moleculares associados com a regulação da dopamina. A maioria destas investigações de regulação de dopamina no cérebro o foco sobre a base molecular para a sua regulação em regiões terminais de campo das vias nigrostiatais e mesoaccumbens; estriado e nucleus accumbens. Além disso, esses estudos têm-se concentrado na análise do teor de tecido da dopamina, com normalização ao peso do tecido apenas molhado. Investigação das proteínas que regulam a dopamina, tais como tirosina hidroxilase (TH), proteína de fosforilação TH, do transportador de dopamina (DAT) e transportador monoamina vesicular 2 (VMAT2) proteína muitas vezes não incluem a análise do teor de dopamina no tecido da mesma amostra. A capacidade de analisar tanto o conteúdo do tecido da dopamina e suas proteínas de regulação (incluindo pós-tramodificações nslational) não só dá o poder inerente ao interpretar a relação da dopamina com o nível da proteína ea função de TH, DAT, ou VMAT2, mas também se estende economia amostra. Isso se traduz em menor custo, e ainda produz insights sobre a regulação molecular da dopamina em praticamente qualquer paradigma de escolha dos investigadores.

Nós nos concentramos nas análises no mesencéfalo. Embora o SN e VTA são normalmente negligenciados na maioria dos estudos de regulação da dopamina, esses núcleos são facilmente dissecados com a prática. Uma leitura abrangente do conteúdo tecido dopamina e TH, DAT, ou VMAT2 pode ser realizado. Não é florescente literatura sobre o impacto da função dopaminérgica no SN e VTA sobre o comportamento, e as imposições de substâncias exógenas ou processos doença nisso ^1-5. Além disso, os compostos, tais como factores de crescimento têm um efeito profundo sobre as proteínas da dopamina e da dopamina-regulador, a uma extensão comparativamente maior no SN ou VTA Iremos ilustrar a técnica de dissecação para segregar estes núcleos duas eo processamento da amostra de tecido dissecado que produz um perfil revelando mecanismos moleculares de regulação da dopamina in vivo, específicas para cada núcleos (Figura 1).

Protocolo

1. Dissecação

1. Sobre um leito de gelo-molhado, arrefecer uma matriz cérebro de roedores (secções coronais segregados 1 milímetro de intervalo), uma placa de Petri contendo 5 lâminas de barbear, e um bisturi # 11. Num recipiente separado, o local de rotulado 2 ml tubos de microcentrífuga de dimensão em gelo seco.
2. O investigador vai escolher o método de eutanásia. Temos resultados reprodutíveis conduzindo uma anestesia muito breve com isoflurano, idealmente, um vaporizador deve ser usado. No entanto, se não estiver disponível, usamos um frasco contendo uma bateria grande plataforma. Com o frasco da bateria localizado em um capuz de ventilação aprova....

Discussão

Conforme descrito na Figura 1, os métodos descritos acima devem produzir leituras múltiplas de dopamina e da sua regulação TH proteínas, DAT e VMAT2 a partir de uma amostra de SN ou VTA obtido a partir de qualquer um rato ou ratinho. Novamente, os benefícios de levar a cabo este protocolo são que o investigador pode obter leituras operacionalmente-combinados de como a dopamina é regulada in vivo sob virtualmente qualquer paradigma experimental e, ao fazê-lo, salvo significativas meios experimentais, reduzindo o.......

Materiais

HPLC sistema:

O sistema de base é constituído por uma bomba Shimadzu HPLC LC10-ADvp, um Waters WISP 717 automático amostra injector, um 250 x 4,4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 coluna de fase inversa C18 (Waters), uma Bioanalytical Systems (BAS) TL12 vítreo dupla eletrodo de carbono, dois detectores de BAS LC4B eletroquímicos, e um Empower Waters 2 de coleta de dados e integração de sistemas.

A coluna é mantida a 30-45 ° C (BAS aquecedor de coluna LC22A). A fase móvel é fosfato de sódio 0,1 M (pH 3,0), EDTA 0,1 mM, 0,2-0,4 mM 1-octano sulfónico (Eastman-Kodak), e acetonitrilo 0,35% (v / v), filtrada através de um filtro de 0,45 micron. Taxa de fluxo é de 1,2 ml / min. Quatro lotes litro de fase móvel são optimizados para separações por ajuste do pH, ácido sulfónico octano e temperatura da coluna. A fase móvel é reciclado, e é continuamente purgado com gás hélio para remover o oxigénio dissolvido. A reciclagem da fase móvelé quase essencial para manter uma boa resolução por um período de tempo razoável. A fase móvel vida de prateleira é mantida por meio de um interruptor de fluxo (controlado pelo integrador) para desviar a perder a 2-7 min antes de cada ensaio.

Os eléctrodos são mantidas em potenciais de cerca de 0,78 e 0.95V com respeito a um eléctrodo de referência Ag/AgC1. O eléctrodo na maior potencial é utilizada exclusivamente para a determinação do triptofano (eo NMDA padrão interno). O potencial 0,78 V fornece um sinal superior à relação de ruído para a detecção das monoaminas e compostos, com excepção do triptofano. Os cromatogramas são armazenados no disco rígido da estação de trabalho Empower, e, posteriormente, processado e os dados transferidos diretamente para uma planilha Excel para o cálculo das quantidades de metabolitos e compilação de dados do grupo.

Bomba: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Carbono vítreo eletrodo de trabalho em 0,780 e 0,950 potencial V.
Detector: BAS LC-4B operado em modo dual channel.
Dados Acq. Sistema: Águas Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Coluna: Waters Spherosorb ODS-1, 5 mM de partícula, 4,4 mm x 250 mm.

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Dodecil sulfato de sódio (SDS)	- JT Baker	4095-02
Trizma Base de Dados	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glicerina	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
DPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Azul de Bromofenol	Sigma	B8026-5G
Ditiotreitol	Sigma	D-9163
Proteína padrão 2 mg de BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent Um	Thermo-Fisher Scientific	23223
Precision Plus padrão de proteína	Bio Rad	161-0373
[125I] Uma proteína, atividade específica	Perkin-Elmer

Tabela 2. Reagentes específicos.

Reagentes	Fórmulas
10% de SDS	10 g de SDS, 100 mL DI H 2 0
SDS a 1% (pH para 8,2)	10 mL10% de SDS 60,5 mg de Trizma base 37,22 mg de EDTA 90 mL DI H 2 0
Cobre solução de sulfato II	1 g de cobre sulfato II 25 mL DI H 2 0
Tampão de amostra 3X	Trizma base de dados de 2,27 g SDS 6 g Ditiotreitol 0,463 g Glicerol 30 g Azul de Bromofenol 10 mg DIH 2 0 (inicialmente adicionar acima reagentes a 40 mL de H 2 0 em um cilindro graduado, em seguida, adicionar H 2 0 até que o volume atinge 100 mL) HCl (adicionar, conforme necessário para alcançar o pH de 6,85) Congelar solução em 50 tubos de 2,0 mL. (Faz 100 mL): Volume de tampão de amostra necessário 3X = ½ volume de SDS utilizados na amostra.
1X tampão de amostra	Diluir Tampão de amostra 3X para baixo para 1X tampão de amostra usando DI H 2 0
10X Tampão de corrida (faz 4 L)	Trizma Base de Dados de 121,1 g Glycine 577 g SDS 40 g
Tampão de Transferência 10X: (Faz 4 L)	Glicina 360 g Trizma base de dados de 96 g
Encarnado vivo	Ponceau S. 0,5 g Ácido Acético 5 mL DI H 2 0 95 mL
0,2% solução de HCl	5,2 ml de HCl em 500mL de DI H 2 0
PVP-T20 de bloqueio Soln. (Faz 4 L)	PVP-40 40 g DPBS 38,2 g Tween20 2 g Thimerisol 0,4 g 1M Tris pH 7,6 (60,6 g Tris HCl + 13,9 g Base de Dados de Tris em 500 mL DI H 2 0) - 50 mL
Tampão 10X Blot (faz 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base de Dados de 14 g Tris-HCl 61 g

ONTEÚDO "Protein Assay> Tabela 3. e ocidentais Fórmulas Blotting.

Padrões tirosina hidroxilase: Os padrões de proteína TH calibrados e fosforilação utilizados por este laboratório são derivados de extratos de células PC12, que foram analisadas para teor de proteína TH e estequiometrias fosforilação contra um TH padrões previamente calibrados que em última análise, oriundos do laboratório do Dr. John Haycock ¹¹ .