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Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens

DOI:

10.3791/4173

November 15th, 2012

In This Article

Summary

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Hemócitos de insetos realizar muitas funções importantes, tanto imunes e não-imunes, em todas as fases do desenvolvimento do inseto. Nosso conhecimento atual de tipos de hemócitos e função vem de estudos sobre insetos modelos genéticos. Aqui, apresentamos um método para extrair, quantificar e visualizar hemócitos de lagartas selvagens.

Abstract

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Hemócitos de insetos (equivalente a mamíferos células brancas do sangue) têm um papel importante em vários processos fisiológicos ao longo do ciclo de vida de um inseto 1. Em estágios larvais de insectos pertencentes à ordem dos lepidópteros (borboletas e traças) e Diptera (moscas verdadeiras), são formados a partir de hemócitos do gânglio linfático (um órgão especializado hematopoiética) ou células embrionárias e pode ser carregado até à fase adulta. Hemócitos embrionários estão envolvidos na migração de células durante o desenvolvimento e a quimiotaxia de regulação durante a inflamação. Eles também participam de apoptose das células e são essenciais para a embriogênese 2. Hemócitos mediar o braço celular da resposta imune inata de insectos, que inclui várias funções, tais como a agregação de células de células difusão, formação de nódulos, e a fagocitose de encapsulamento de invasores estranhos 3. Eles também são responsáveis ​​por orquestrar específicas de insectos defesas humorais durante a infecção, tais como a produção de péptidos antimicrobianos e outras moléculas efectoras 4, 5. Hemócitos morfologia e função têm sido principalmente estudados em modelos genéticos ou fisiológica de insectos, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster 6, 7, os mosquitos Aedes aegypti e Anopheles gambiae 8, 9 e o hornworm tabaco, Manduca sexta 10, 11. No entanto, pouca informação existe atualmente sobre a diversidade, classificação, morfologia e função de hemócitos em espécies não-modelo de insetos, especialmente aqueles coletados de 12 a selvagem.

Aqui nós descrevemos um protocolo simples e eficiente para extrair hemócitos de lagartas selvagens. Usamos penúltimo estádio Lithacodes fasciola (amarelo Traça lesma) (Figura 1) e Euclea delphinii (spiny lesma carvalho) lagartas (Lepidoptera: Limacodidae) e mostram que os volumes suficientes de hemolinfa (sangue do inseto)pode ser isolado e os números contados a partir de hemócitos larvas individual. Este método pode ser utilizado de forma eficiente para estudar tipos de hemócitos nestas espécies, bem como em outras lagartas relacionados colhidas a partir do campo, ou pode ser facilmente combinado com ensaios imunológicos concebidos para investigar a função hemocitária após infecção com micróbios ou parasitas 13.

Protocol

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1. Preparação de material

  1. Prepare agulhas (1-2 ponta fim e cone 3-4 mm) de tubos de vidro de borosilicato capilares e um extrator micropipeta. Configurações do instrumento: rampa: 561, velocidade: 20; calor: 560; atraso: 1; tração: 100; pressão: 500.
  2. Preparar a solução de recolha: 60% de meio de Grace (GM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) a 20% de Tampão de anticoagulante (98 mM NaOH, 186 mM de NaCl, 1,7 mM de EDTA e 41 mM de ácido cítrico, pH 4,5 ). A solução acima é preparada em condições estéreis e mantido em gelo em todos os momentos.
  3. Preparar a solução de tampão de incubação: 90% do GM suplementado com 10% de FBS. E....

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Results

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O protocolo aqui descrito permite a recolha de um volume mínimo de 10-20 ul de hemolinfa de larvas de insectos individuais. Hemócitos recolhidas utilizando este método são livres de agregação de células, defeitos de melanização, restos de tecido ou outros contaminantes. Portanto hemócitos podem ser facilmente observados e contados sob o microscópio, e vários insectos pode ser observado no prazo de uma Hosur poucos. Observou-se que a maioria dos hemócitos em nossas amostras consistiu de 3 (plasmatócitos hemóci.......

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Discussion

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Métodos para a extração de hemócitos de insetos de importância médica e insetos lepidópteros modelo foram relatados 9, 14. Métodos de extração de hemócitos são adaptados de acordo com as espécies de insetos, o estágio de desenvolvimento do inseto e suas características morfológicas. Por exemplo, o isolamento a partir da hemolinfa de larvas Manduca pode ser prontamente realizada cortando o chifre curvo perto do fim do abdómen 15. Porque lagartas Slug (Limacodidae) não possuem essa estrutura.......

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Disclosures

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Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

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TMS foi apoiado pela confiança Harlan Fellowship (UGT) durante este estudo. O financiamento para a coleta de campo e criando L. fasciola e E. delphinii foi fornecido pela concessão do NSF DEB 0642438 para JTL.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários
Micropipeta extrator Sutter Instruments P-1000
Tubos de vidro de borossilicato Sutter Instruments B100-50-10 OD: 1.0, ID: 0,50 milímetros
Meio de Grace Sigma G8142
Soro Fetal Bovino Thermo Fisher Scientific SH3007102 Inactivado por calor
Dumont n º 5 Fórceps Belas ferramentas da ciência 11252-40
Câmara de Neubauer Hausser Scientific 3200
Plástico tubing Tri-Tech TT-3-32OD OD: 3/32'', ID: 1/32 '
Médicas de vidro seringa Fortuna Optima D-97877 Volume de 50 ml
Agulha de ponta romba Peças pequenas NE-162PL-25 Calibre 16 x 1 comprimento "

References

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  1. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677(2006).
  2. Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8....

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