Proteínas de ligação de gelo (IBPS), também conhecidas como proteínas anticongelantes, inibir o crescimento do gelo e são um aditivo promissor para uso na criopreservação de tecidos. A principal ferramenta utilizada para investigar IBPS é o osmómetro nanolitro. Nós desenvolvemos uma casa projetada fase de arrefecimento montado em um microscópio óptico e controlados usando uma custom-built rotina LabVIEW. O osmómetro nanolitro descrito aqui manipulado a temperatura da amostra de forma ultra-sensíveis.
Artigo de método
LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas
Neste artigo
Resumo
Resumo
Proteínas ligantes a gelo (IBPs), incluindo proteínas anticongelantes, proteínas estruturantes de gelo, proteínas de histerese térmica e proteínas inibidoras da recristalização de gelo, são encontradas em organismos adaptados ao frio e os protegem de lesões por congelamento ao interagirem com cristais de gelo. As IBPs são encontradas em uma variedade de organismos, incluindo peixes1, plantas2, 3, artrópodes4, 5, fungos6 e bactérias7. As IBPs adsorvem-se às superfícies de cristais de gelo e impedem que moléculas de água se incorporem à rede cristalina de gelo no local de adsorção da IBP. O gelo que cresce sobre a superfície do cristal entre as IBPs adsorvidas desenvolve uma alta curvatura que reduz a temperatura na qual os cristais de gelo crescem, um fenômeno conhecido como efeito Gibbs-Thomson. Essa depressão cria uma lacuna (histerese térmica, HT) entre o ponto de fusão e o ponto de congelamento em não equilíbrio, dentro da qual o crescimento do gelo é interrompido8-10, veja Figura 1. Uma das principais ferramentas utilizadas na pesquisa de IBPs é o osmômetro de nanolitro, que facilita a medição da atividade de HT em soluções de IBPs. Osmômetros de nanolitro, como o instrumento Clifton (Clifton Technical Physics, Hartford, NY) e o instrumento Otago (Otago Osmometers, Dunedin, Nova Zelândia), foram projetados para medir a osmolaridade de uma solução por meio da medição da depressão do ponto de fusão em gotas com volumes de nanolitro. Esses dispositivos foram usados para medir as osmolaridades de amostras biológicas, como lágrimas11, e mostraram-se úteis na pesquisa de IBPs. O controle manual desses osmômetros de nanolitro limitava as possibilidades experimentais. As variações na taxa de temperatura não podiam ser controladas de forma confiável, a faixa de temperatura do instrumento Clifton era limitada a 4.000 mOsmol (cerca de -7,5 °C), e o registro da temperatura em função do tempo não era uma opção disponível para esses instrumentos.
Desenvolvemos um sistema personalizado de osmômetro de nanolitros controlado por computador utilizando uma plataforma LabVIEW (National Instruments). O estágio frio, descrito anteriormente9, 10, contém um bloco metálico pelo qual circula água, funcionando assim como um dissipador de calor, veja Figura 2. A este bloco estão acoplados resfriadores termoelétricos que podem ser operados por meio de um controlador de temperatura comercial, o qual pode ser comandado por módulos LabVIEW, veja Figura 3. Mais detalhes são fornecidos abaixo. A principal vantagem deste sistema é o controle sensível de temperatura, veja Figura 4. O controle automatizado de temperatura permite a coordenação de uma rampa de temperatura fixa com uma saída de microscopia de vídeo contendo detalhes experimentais adicionais.
Para estudar a dependência temporal da atividade TH, testamos uma IBP hiperativa de 58 kDa da bactéria antártica Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. Esta proteína foi marcada com proteínas fluorescentes verdes aprimoradas (eGFP) em um construto desenvolvido pelo grupo de Peter Davies (Universidade de Queens)10. Demonstramos que o perfil de variação de temperatura afetou a atividade TH. Um excelente controle sobre o perfil de temperatura nestes experimentos melhorou significativamente as medições de TH. O osmômetro de nanolitros permitiu-nos adicionalmente testar a inibição da recristalização por IBPs5, 13. Em geral, a recristalização é um fenômeno no qual cristais maiores crescem às custas de cristais menores. As IBPs inibem eficientemente a recristalização, mesmo em baixas concentrações14, 15. Utilizamos nosso osmômetro controlado por LabVIEW para acompanhar quantitativamente a recristalização do gelo e para manter uma fração constante de gelo, mediante análise em tempo real simultânea das imagens e retroalimentação térmica da câmara da amostra13. Os cálculos em tempo real oferecem opções adicionais de controle durante o procedimento experimental. Foi desenvolvida uma platina para microscópio invertido para acomodar dispositivos microfluídicos com controle de temperatura, os quais serão descritos em outro lugar16.
O Sistema de Estágio Frio
A montagem do estágio frio (Figura 2) consiste em um conjunto de refrigeradores termoelétricos que resfriam uma placa de cobre. O calor é removido do estágio por meio da circulação de água fria através de um compartimento fechado localizado sob os refrigeradores termoelétricos. Um orifício de 4 mm de diâmetro no centro da placa de cobre serve como janela de visualização. Um orifício plano de 1 mm de diâmetro foi perfurado para acomodar o termistor. Um disco de cobre personalizado (7 mm de diâmetro) com vários orifícios (500 μm de diâmetro) foi colocado sobre a placa de cobre e alinhado com a janela de visualização. O ar foi bombeado a uma taxa de fluxo de 35 ml/s e seco utilizando Drierite (W.A. Hammond). O ar seco foi utilizado para garantir um ambiente seco no estágio de resfriamento. O estágio foi conectado, por meio de uma saída de conexão de 9 pinos, a um controlador de temperatura (Modelo 3040 ou 3150, Newport Corporation, Irvine, Califórnia, EUA). O controlador de temperatura foi conectado, por meio de um cabo, a uma placa GPIB-PCI de computador (National Instruments, Austin, Texas, EUA).
Protocolo
0. Procedimentos preliminares
- Capilar de vidro para injectáveis solução. Usando um extrator capilar (Narishige, Tóquio, Japão), preparar uma pipeta afiada com uma abertura fina a partir de um tubo capilar de vidro micro (Marca GMBH, Wertheim, Alemanha). O tamanho da abertura deve ser verificada por passagem de ar através do capilar para obter borbulhante fina em água limpa. Se o capilar é fechado, então pode-se abri-lo por quebrar sua borda. Isto pode ser feito por prensagem ou arranhar o suavemente contra a água contendo paredes do tubo. Prepare o capilar tal que a abertura está quase bloqueada, mas é suficientemente aberta para permitir a formação de sub-milímetros bolhas.
- Limpeza de cobre disco. Sonicar os discos de cobre durante 10 min em 0,1% de Micro-90 sabão (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, EUA), depois lava-se com água duplamente destilada. Introduzir os discos em uma solução de isopropanol (técnico) e sonicar novamente durante 10 min. Barbatanaaliado, seque os discos usando ar filtrado. Esta fase de limpeza é crítico para evitar a contaminação entre IBP experimentos.
- De camada dupla montagem lamela. A montagem lamela foi preparada para permitir a observação da amostra sem condensação de humidade sobre a superfície do vidro de cobertura. Isto foi conseguido através da colocação de uma partícula de Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, EUA), (2 mm de diâmetro) entre duas lamelas, que foram, em seguida, colados com uma pistola de cola quente. Esta configuração impedido condensação que poderia bloquear a vista quando a amostra foi arrefecida a baixa temperatura e elimina a necessidade de soprar ar seco para a janela de observação.
1. Estágio de resfriamento Set-up
- Ligue a entrada do fluxo de água e de saída da fase de arrefecimento a 4 mm de diâmetro interno Tygon tubos (Saint-Gobain, Paris, França), e ligar o tubo de entrada de água do fluxo de uma bomba de água.
- Ligar um tubo Tygon 4 milímetros de diâmetro interno para a entrada da etapa de arrefecimento tó fornecer ar seco. O ar foi seco utilizando uma coluna de linha Drierite.
- Operar as bombas de ar e água. Note-se que os elementos de resfriamento não deve ser executado sem um dissipador de calor.
- Ligue o controlador de temperatura, câmera e rotineira LabVIEW.
2. Preparação da Amostra
- Colocar uma gota 3-4 ul de imersão em óleo B (laboratórios Cargille, Cedar Grove, New Jersey, EUA), no lado de trás de um disco de 7 mm de diâmetro de cobre com 500 furos perfurados uM através do disco.
- Posicionar o disco de cobre na fase de arrefecimento, com o lado voltado para baixo de imersão em óleo.
- Ligar o tubo capilar (a ponta chanfrada) para um tubo de 0,7 milímetros Tygon diâmetro interno ligada na outra extremidade a uma seringa de vidro de 2 ml (Poulten-Graf, Wertheim, Alemanha).
- Antes de utilizar o tubo capilar, verificar a pequena abertura do capilar de forma que a abertura é um tamanho apropriado (ver os procedimentos preliminares).
- Insira lentamente o glass capilar para o tubo de amostra preparada IBP proteína (2,4 uM Mp IBP-GFP em 20 mM de CaCl 2 e 25 mM Tris-HCl a pH 8, ver referência 10 para os pormenores de preparação) e puxar a seringa de vidro até que o capilar de vidro contém 0,1 ul da solução de proteína.
- Iniciar a gravação de vídeo através do software LabVIEW.
- Inserir a ponta afiada do capilar de vidro (contendo a solução de proteína) em um dos furos do disco de cobre na fase de arrefecimento.
- Enquanto observa através do microscópio (Olympus, Tokyo, Japan, objectiva 10x), cuidadosamente penetrar a camada de óleo de imersão com a ponta capilar de vidro, e pressionar a seringa de vidro (muito delicadamente) para entregar uma pequena quantidade (~ 10 nl) da proteína solução para criar uma gotícula uM 200.
- Cobrir o furo na fase de arrefecimento, com a montagem de dupla camada lamela (ver os procedimentos preliminares).
3. Medição de Actividade TH
- Préss botão do arrefecimento e ajustar a temperatura a -40 ° C.
- Inicialmente, a gota de solução será clara. A baixas temperaturas, tipicamente na gama de -30 ° C a -35 ° C, gota a muda de cor, indicando que a solução tenha sido congelada. Imediatamente após a amostra ter congelado, aumentar a temperatura lentamente até que o gelo começa a derreter a granel. Um aumento gradual da temperatura é necessária para evitar a ultrapassagem da temperatura que pode resultar na fusão completa da amostra.
- Mudar para um objectivo de 50x e começar a derreter o gelo, ajustando a temperatura. Este ajuste é interativo, e os passos finais são normalmente realizadas utilizando medidas de temperatura de pequenas 0,002 ° C. Continuar a fundir antes de um único cristal permanece. O tamanho final do cristal deve ser cerca de 10 um. A temperatura mais alta à qual tenha cessado de fusão é determinado como sendo o ponto de fusão e é determinado com precisão na fase posterior análise vídeo.
- Ajustar a temperatura para alguns centésimos de um grau Celsius abaixo do ponto de fusão do cristal e começar uma rampa de temperatura com um atraso de 10 minutos. Ajuste a velocidade de rampa, como desejado. Durante este tempo, o cristal será exposto aos IBPS.
- Após a conclusão do período de exposição de 10 min, a temperatura diminui automaticamente sob o controlo de rotina de LabVIEW.
- Observar a forma dos cristais à medida que diminui a temperatura. Em algum momento, a súbita explosão de cristal de gelo pode ser observado. A temperatura à qual ocorre esta é conhecida como a temperatura de ruptura do cristal.
- Usar a análise de vídeo para determinar o ponto de fusão preciso e a temperatura de ruptura. Primeiro, por meio de análise de vídeo, encontrar o ponto de fusão precisa. Recorde-se que a mais alta temperatura a que tenha deixado de fusão é determinado como sendo o ponto de fusão. Documentar este ponto de fusão, em um programa de planilha. Em seguida, determinar a temperatura de ruptura precisa de cristal, e documentar este valortambém. A diferença entre o ponto de fusão e o ponto de congelação, temperatura de ruptura ou de cristal, é a actividade de histerese térmica da solução de IBP.
4. Medição da Actividade TH tempo-dependente
- Seguir o protocolo descrito nas Secções 3,1-3,3 para preparar um único cristal de gelo.
- Após a formação do cristal, ajustar o tempo de retardamento da rampa conforme desejado, e ligar a rampa.
- A temperatura irá diminuir a uma taxa fixa (de acordo com os requisitos dos operadores) automaticamente uma vez que o tempo de atraso de rampa passou.
- Documentar a temperatura a que ocorre a ruptura de cristal. Calcula-se o tempo de exposição (o tempo entre a formação de cristais e do impulso de cristal).
- Repita a experiência para vários tempos de atraso e representar graficamente a actividade TH como uma função do tempo de exposição para avaliar a dependência do tempo da actividade TH.
Resultados
A medição do tempo de dependência TH
O LabVIEW operado osmómetro nanolitro facilita o desempenho de medições precisas de atividade TH. A taxa de redução da temperatura constante permitiu a medição da dependência do tempo TH. O controle preciso da temperatura activado pelo osmómetro nanolitro era crucial para estas experiências. O tempo de exposição de um cristal de gelo para os IBPS em solução é definido como o período de tempo desde a formação do cristal (no final do processo de fusão) até que o crescimento súbito de gelo em volta do cristal (burst cristal). Nós descobrimos que o tempo de exposição dos cristais de gelo para os IBPS crucialmente afectaram a actividade TH. Períodos curtos de exposição ao IBP (alguns segundos), produzida uma actividade TH baixo na solução Mp IBP-GFP (2,4 mM) (Figura 5). A atividade TH aumentou com o tempo de exposição IBP até atingir um patamar de 4 minutos de exposição IBP. A concentrações mais elevadas do IBP, a placaau foi alcançado em menor tempo.
Figura 1. IBPS diagrama esquemático que ilustra adsorvido em gelo. Aprovada com a permissão de 10.
Figura 2. A fase de arrefecimento. A) Ligação a tubos no microscópio. B) Sem ligação superior. C) Diagrama esquemático.
Figura 3. Screenshot da interface do LabVIEW. ClIck aqui para ver maior figura.
Figura 4. Gráfico a estabilidade da temperatura. O controlador de temperatura foi ajustado para diminuir a temperatura de 0.01 ° C a cada 15 segundos.
Figura 5. Mp actividade TH IBP como uma função do tempo de exposição de cristal de gelo com as IBPS. Cada ponto de tempo é a média de 3-6 experiências.
Discussão
Este trabalho demonstra o funcionamento de um osmómetro nanolitro, controlado por computador, que permite medições precisas da actividade TH com controlo de temperatura excepcional. Em qualquer sistema sensível à temperatura, gradientes de temperatura indesejáveis devem ser evitadas. Para evitar gradientes de temperatura no aparelho aqui apresentado, a gota de solução de teste deve ser posicionada no centro de um furo na fase de arrefecimento de cobre do disco (passo 2.7). Além disso, o cristal único deve estar no centro da gota em vez de junto das extremidades (na maioria dos casos, isto irá acontecer espontaneamente). A dependência do tempo descrito indica que a taxa de arrefecimento pode influenciar as leituras TH. Assim, sugere-se que inclua um relatório de tempo durante o qual o cristal foi exposta à solução antes do arrefecimento, assim como a velocidade de arrefecimento. Nós normalmente esperado 10 min antes da rampa para baixo a temperatura de 0.01 ° C passos cada sec 4.
Os co LabVIEW controladosfase oling foi adaptado para utilização com um microscópio invertido no qual os dispositivos microfluidicos podem ser termicamente manipulado. Este sistema facilita a realização de experimentos solução de intercâmbio de cristais de gelo e IBPS marcados com eGFP 9, 10, 16. O sistema LabVIEW-controlada pode ser adaptado a uma fase Clifton, ligando o controlador de temperatura de 3040 através de um circuito de adaptação designada eléctrico. Tal sistema é operado no laboratório Davies 17. O software LabVIEW ea designada projeto de circuito elétrico adaptação para o palco Clifton estão disponíveis mediante solicitação.
Em conclusão, nós descrevemos um osmómetro nanolitro, que facilita o controlo sensível e manipulação de temperatura e a taxa de aumento de temperatura e diminuição (0,002 com sensibilidade ° C), coordenado com uma interface de vídeo através de uma rotina de LabVIEW para análise em tempo real. Este sistema pode realizar reprodutíveis taxa controlada experiências que são important para investigar a cinética de interações IBP com gelo. Tais experiências podem resolver vários longo debatidas questões que envolvem o mecanismo de ação do IBPS.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela ISF, NSF, e ERC. Nós gostaríamos de agradecer a ajuda técnica com a fase de temperatura de Randy Milford, Michael Koren, Shafer Doug, e Dennison Jeremy. Assistência ao desenvolvimento de software foi fornecido pela Ou Chen, Xu Di, Sannareddy Rajesh, e Bhattachary Sumit. Gostaríamos de agradecer aos nossos colaboradores o professor Peter L. Davies e Dr. Laurie A. Graham para a proteína IBP MP e discussões úteis. Agradecemos também laboratório membros Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr. Yeliz Celik, Dr. Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, e Guy Shlomit para seu feedback do usuário.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome | Companhia | Número de catálogo / modelo | Comentários |
| Imersão em óleo Tipo B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | WA Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro solução de limpeza 90 | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| Capilar extrator | Narishige | PB-7 | |
| Tubos capilares de vidro | Marca GnbH Pessoa | 7493 21 | 75 mm, 1,15 Diâmetro |
| Temperaturacontrolador | Newport, Irvine, Califórnia, Estados Unidos | Modelo 3040 | Modelo 3040 |
| Microscópio óptico | Olimpo | Modelo BH2 | |
| Objetiva de 10x | Olimpo | Plano S 10, 0.3, 160/0.17 | |
| Objetivo 50x | Nikon | CF plano, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| Câmera CCD | Provideo | CVC-140 | |
| Tubos de Tygon | Saint-Gobain, em Paris, França | Formulação Tubing Tygon S-50-HL | |
| Seringa de vidro (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Alemanha | 7 10227 | |
| GPIB-PCI | National Instruments, Austin, Texas, EUA | 778032-01 | |
| Vídeo quadro grabber IMAQ-PCI-1407 | National Instruments, Austin, Texas, EUA | 322156B-01 | |
| LabVIEW Software System Design | National Instruments, Austin, Texas, EUA | Versão 8 | |
| O software DivX Autor | Divx LLC, San Diego, CA, EUA |
Referências
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
Reimpressões e permissões
