Purificação Citometria de Fluxo com base em<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zigotos

Resumo

Para purificar de zigotos S. cerevisiae, Células haplóides do tipo de acasalamento oposto foram projetados para expressar vermelho ou verde proteínas fluorescentes, co-incubados, para permitir a formação do zigoto, e fracionado em um fluxo de protocolo de citometria de base. A fração altamente enriquecido permite posterior "-mico" estudos de recuperação, de progênie inicial, e investigação sistemática da morfogênese zigoto.

Resumo

Zigotos são intermediários essenciais entre haplóides e diplóides estados do ciclo de vida de muitos organismos, incluindo levedura (Figura ¹⁾ 1. S. cerevisiae zigotos resultado a partir da fusão de células haplóides de tipo de acasalamento diferente (MATa, MATalpha) e dar origem aos correspondentes diplóides estáveis ​​que geram sucessivamente até 20 descendentes diplóides, como resultado das suas divisões mitóticas notavelmente assimétricas ^2. Formação do zigoto é orquestrado por uma sequência complexa de eventos: Neste processo, os factores de acasalamento solúveis se ligam a receptores de cognato, desencadeando mediados por receptores cascatas de sinalização que facilitam a interrupção do ciclo celular e culmina na fusão célula-célula. Zigotos podem ser considerados um modelo para progenitor ou a função das células estaminais.

Embora muito se aprendeu sobre a formação de zigotos e, apesar de zigotos foram utilizados para investigar células-moleculares questões de interesse geral significance, quase todos os estudos fizeram uso de misturas de acasalamento em que os zigotos estão misturadas com uma população de maioria de células haplóides ^3-8. Muitos aspectos da bioquímica da formação do zigoto ea vida continua do zigoto, portanto, permanecem sem investigação.

Relatos de purificação de zigotos levedura descrevem protocolos baseados nas suas propriedades de sedimentação ^9, no entanto, este procedimento de sedimentação baseada não produziram cerca de 90% de pureza em nossas mãos. Além disso, ele tem a desvantagem de que as células são expostas ao sorbitol hipertónica. Por conseguinte, desenvolveram um processo de purificação versátil. Para este propósito, os pares de células haplóides que expressam proteínas de vermelho ou verde fluorescentes foram co-incubadas para permitir a formação do zigoto, colhidas a vários tempos e os zigotos resultantes foram purificadas utilizando um protocolo de triagem de citometria de fluxo com base. Esta técnica fornece uma avaliação visual conveniente de pureza e de maturação. A pureza médiada fracção é de cerca de 90%. De acordo com o tempo de colheita, os zigotos de diferentes graus de maturidade podem ser recuperados. As amostras purificadas fornecer um conveniente ponto de partida para "-OMIC" estudos, para a recuperação da progênie inicial, e para a investigação sistemática desta célula progenitora.

Protocolo

1. Crescimento Celular haplóide

1. Crescer S. células de Saccharomyces do fundo S288C (BY4741) sob condições padrão ^10.
2. Transformar haplóides para expressar qualquer uma das duas notáveis ​​marcadores fluorescentes ^10. Os marcadores de escolha são GFP solúvel expressa no citoplasma (pEG220, URA3/YIp, linearizado com BglII ¹¹⁾ e uma única proteína ribossomal, RPL25, fundido com mCherry (pAJ1661, URA3/CEN, a partir de A. Johnston). Prevemos que os protocolos equivalentes de duas cores de purificação pode fazer uso de outras proteínas fluorescentes brilhantes que são sintetizadas pelas células haplóides paternos. Em alternativa, a parede celular pode ser rotulado com lectinas fluorescentes.
3. No dia anterior ao do zigoto purificação, inocular 5 ml de culturas de cada tipo de célula e crescê-los com agitação durante a noite a 23 ° C até atingir A600 não superior a 1,0. Crescer transformantes GFP (ATY4442) em meio sintético completo incluindo 2% de glicose (CSM-glucose) umnd RPL25-mCherry transformantes (ATY4552) em meio selectivo sintético sem uracilo ^10. Manter culturas paralelas de cada tipo de célula com agitação, à temperatura ambiente.

2. Realização de uma Cruz

1. Ajustar a densidade óptica (A600) de cada amostra para 1,0 em meio fresco. [1 Unidade Densidade Óptica ~ 3 x 10 ⁷ células / ml]
2. Mistura de volumes iguais de ambas as culturas, vortex brevemente três vezes, seguido por um tempo de vórtice durante 10 seg.
3. Prepare CSM glicose placas. As placas são idênticos aos utilizados para o crescimento de rotina e foram secas 45 minutos após o vazamento e a solidificação do agar ^10.
4. Distribuir até vinte gotas de 40 ml da mistura a 1 centímetro a partir do bordo da superfície de CSM-glucose placas. Quando as gotas são inicialmente aplicada à superfície de iniciar o temporizador para medir o tempo decorrido. Uma vez que o líquido ter sido absorvido (cerca de 30 min), cobrir as placas e deixar intacta a rooTemperatura m.

3. Preparações de colheita

1. Colheita de amostras após 1,75-2,5 hr a 23 ° C por lavagem repetidamente individuais gotículas secas ao lado da placa com 150 ml de glucose-CSM frio, mantendo-se as placas em gelo. Repetidamente lavar a área de gotículas 10-20 vezes com o mesmo meio para maximizar a recuperação. Recolher em tubos de 15 ml Falcon em gelo.
2. Sondar sonicar as amostras 10x em amplitude de 60% com um sonicador Fisher FB120 (120watt, 120Volt, Freq 20KHz) em gelo.
3. Verificar em um microscópio de fase que poucos ou nenhuns agregados permanecem. 15-50% das células espera-se que se formaram zigotos neste ponto.
4. Deixar o tubo de células numa posição vertical em repouso sobre gelo durante 10 minutos, como medida de precaução adicional (para permitir que os agregados se estabelecer).
5. Recuperar os 90% mais alto do volume e filtrá-la através de uma malha de nylon (BD Falcon tubo de polipropileno com filtro tampa (Ref. 352235)). Numa experiência típica, 10 ⁷ célulasrecuperado a partir de uma placa foram neste ponto diluídos em 4 mL de CSM-glucose.

4. Citometria de Fluxo

1. Ordenar células usando o Sony Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo, (altamente automatizado Ordenar Paralela) HAPS1 com uma ponta mícron 100. Para a excitação da GFP, use o azul argônio-ion, 250 miliwatts de laser a 488 nm. Para excitação mCherry, use o laser de 100 miliwatts a 561 nm. Apesar de não ter experiência com outras máquinas, esperamos que Becton Dickinson FACSAria, Becton Dickson Influx ou Beckman Coulter MoFlo XDP ficaria bem quando equipado com os lasers corretas.
2. Base de dados de parâmetros de classificação em um gráfico de dispersão para a frente contra volta, a fim de porta em células viáveis. Estabelecer um plano de emissão de 615 + / - 30 nm filtro passa-banda (mCherry) versus 525 + / - 25 nm filtro passa-banda (GFP) para dividir os eventos em quatro quadrantes, "Red + Verde", "Vermelho + Verde +", "Red- Verde-"e" + Red-Green "(Figura S2). Utilização de células não fluorescente como um padrão fou determinação do "vermelho-verde" quadrante.
3. Ordenar as células com uma pressão de 21,5 psi bainha, uma frequência de 43.400 gota gotas / seg, e uma pressão da amostra de 20,5 psi.
4. Ordenar inicial ("modo de recuperação"): Recolha de amostras em tubos refrigerados Eppendorf contendo 250 ml de frio CSM-glicose. Sedimento 10 seg a velocidade máxima numa microcentrífuga refrigerada (Tomy MRX-150, 15.000 rpm) e aspirar a solução de fluxo (fluxo de solução de revestimento de citometria (PBS com EDTA 1 mM) Catalog No. BioSure 1027). Ressuspender em 500 ml frio CSM-glucose.
5. Ordenar segundo ("Modo de Pureza"): Conduzir a espécie como para a classificação inicial, usando a "pureza" modo opção. O sedimento. Purificada células e ressuspender as pastilhas em 500 ml e 1,0 ml de glucose-CSM Agitar durante 15 minutos em placas de 24 poços a 23 ° C para permitir a recuperação metabólica.

5. Microscopia DeltaVision

1. Preparar almofadas de agarose, como se segue: Leve uma suspensão de agarose 1,5% (UltraPureAgarose, Invitrogen, Catalog # 15510-07) em CSM-glucose a ferver, de forma breve vórtice, e depois aplicar 0,3 ml de amostras da solução de agarose para a superfície de lâminas de vidro horizontais normais e cobri-los de uma só vez com uma segunda corrediça (sem a aplicação de pressão).
2. Depois de arrefecimento durante 10 minutos, remover suavemente a corrediça superior, deslizando-a na horizontal, tendo o cuidado de deixar uma superfície lisa e não perturbar a camada de agarose. (Quando a lâmina superior tenha sido removido, a amostra de células deve ser aplicado dentro de 1-2 min. Quando mantido numa câmara húmida à temperatura ambiente, sem a remoção da lâmina superior, as almofadas podem ser armazenados durante até um dia antes do uso.)
3. Amostras de sedimentos e depósitos alíquotas de 1 ml da pelota em almofadas de agarose (sem tocar na superfície). Cobrir imediatamente a amostra com um quadrado No. 1 lamela. Aparar agarose excesso com uma lâmina de barbear única gumes. Selar as preparações com vaselina dispensados ​​a partir de uma seringa.
4. Imagem usando Deltavision (Applied Precision) com um objetivo 100x óleo de imersão sem binning (Olympus UPlanApo 100x/1.40; ∞ / 0.17/FN26.5).
5. Deconvolve z pilhas usando o programa softWoRx 5.0.0 ( http://www.api.com/softworx.asp ) e processar minimamente. Sucessivas z-aviões eram geralmente coletados em intervalos de 0,2-0,4 mícron.

6. Resultados representativos

Os níveis de intensidade de fluorescência em células haplóides transformadas: O nível de fluorescência nas haplóides é ilustrado na Figura S1. Antes da inquirição, epifluorescência demonstrado que essencialmente todas as transformantes GFP estavam verdes, e que todas as transformantes mCherry, embora muitas vezes fraca, estavam vermelhos. Para assegurar que todas as células utilizadas para a cruz eram realmente fluorescente, foi utilizada a sub-população mais brilhantes com o sinal fluorescente.

Rendimento: Aepois de a classificação inicial, a amostra verde vermelho + + (Figura S2) inclui tipicamente 8-20% do número de células de entrada e um número excessivo de células haplóides, talvez devido à adesão célula-célula persistente. Uma vez que o enriquecimento de alta não é conseguido com uma única espécie, a amostra parcialmente purificada deve ser duas vezes a sonda de ultra-sons 60% de amplitude seguido por re-ordenação. (Tipo de recuperação duram tipicamente entre 1-2 horas, enquanto que o segundo tipo requer apenas 15 min.) Das células submetidas ao segundo tipo, os vermelho + verde + amostras incluíram 23-52% das células de entrada.

Exame microscópico fase: Exame por microscopia de contraste de fase revelou que a pureza da preparação final, zigoto em média cerca de 90% ao longo de 21 preparações (variando de 86% a 91%). Os contaminantes ou eram haplóides verde ou vermelha, ou pares de haplóides que estavam em contacto uns com os outros. Figura 3 tabula a percentagem de zigotos que têmnão broto, brotos medial (Med), brotos laterais (Lat) ou botões terminais (Term), o número de haplóides emparelhados da mesma cor ("2Same") ou de cor diferente ("2Hap"), bem como individuais (haplóides Hap). Quando as células foram colhidas após 1,75 hr, mais do que 50% foram não gemuladas e as outras subcategorias (medial, com gemas laterais ou terminais) foram igualmente representados. Depois de 2,5 horas, havia aproximadamente números iguais de zigotos em cada uma das quatro categorias (não gemuladas, com medial, gomos laterais ou terminais).

As observações microscópicas (Figura 4):

A estrutura de zigotos parece permanecer inalterado durante a purificação. De acordo com a duração da cruz, a população tinha diferentes proporções de zigotos e não gemuladas enxertada, como explicado acima. Uma vez que ambos os haplóides verdes e vermelhos mostrou uma variação considerável na intensidade do sinal fluorescente, alguns zigotos foram predominantemente vermelha, enquanto os outros foram predominantemente verde, como é observado por Comparing as imagens de uma só cor para as imagens combinadas na Figura 4. Note-se também que a GFP (MW 26kDa) entra no núcleo e pode ser encontrado no núcleo, mesmo quando os núcleos não se fundiram. Vacúolos destacam-se como negros não fluorescentes esferas.

O produto final de purificação produz uma população diversa em diferentes fases de desenvolvimento. Zigotos rotulado Uma fusão não tenham sofrido. Zigotos Tipo B são não gemuladas. Tipo C tem um pequeno broto. Tipo D têm uma maior broto, e zigotos Tipo E está prestes a passar por citocinese. Note-se também que muitos dos zigotos anteriores continuam a mostrar um não-fluorescente linha de divisão medial (*), e que a "estrutura de herança" vacuolar (I) ¹² podem ser vistos a estender a partir do zigoto para a raiz. Em alguns casos, o sinal verde foi redistribuído para o parceiro de uma extensão muito maior do que o sinal vermelho. Isto reflecte o atraso de transferência, que é característica de polissomas (Tartakoff, em preparação).

A partir de um par de 5 ml culturas logarítmicas de células haplóides, recuperamos aproximadamente 1-2 x 10 ⁶ zigotos, o que é suficiente para muitas imunotransferência, utilizando os procedimentos de detecção quimioluminescente. Usando protocolos de fenol-clorofórmio isolamento extraímos cerca de 1,5 mg de RNA a partir deste número de células.

Uma vez que os zigotos purificadas ter sido refrigerada, antes de análise adicional é recomendável a incubação a 23 ° C em meio de crescimento.

Figura 1. Cronologia da formação do zigoto. Zigotos como um intermediário entre haplóides e diplóides. Este diagrama mostra a activação clássica (shmooing) de haplóides, a sua fusão e a formação da gema inicial. Gemas podem ser tanto medial (M), lateral (L) ou do terminal (T).

Figura 2. Esquemática do protocolo de purificação do zigoto. Após a incubação sobre a superfície de placas de agar, em meio completo com glucose, a mistura de células foi recuperado por lavagem e, em seguida, submetido a uma classificação inicial no "modo de recuperação", seguido de um segundo tipo em "modo de pureza. " A cor amarela indica que tanto mCherry e sinais de GFP foram visíveis nos zigotos.

Figura 3. Variedades de zigotos nas misturas de acasalamento purificadas frações. Foram colhidas após 1,75 ou 2,5 horas para recuperar frações enriquecidas em zigotos relativamente precoces vs relativamente mais maduro. Oito experimentos independentes, designados pelas cores distintas, foram realizadas para cada ponto de tempo. Os gráficos indicam os números relativos de zigotos que have espacialmente padrões distintos de formação de gemas. Dada a curta duração da incubação (menos de 2,5 h à temperatura ambiente) os botões são observados eventos iniciais zigóticos de brotamento.

Figura 4. DeltaVision exame das fracções enriquecidas. Um campo típico foi examinada por microscopia Deltavision. As ilustrações mostram ou cores vermelhas e verde ou único. O vermelho corresponde à etiqueta polissomal (Rpl25p-mCherry) e o verde para GFP citosólica. Note-se a elevada enriquecimento de zigotos, e as características designadas subcelulares: os vacúolos (v), de botões (b), o núcleo (n), vacuolar "estrutura de herança" (i), e a divisória (*) que aparece para separar o parental domínios em zigotos relativamente cedo. A sua cor variável global reflecte a intensidade relativa dos haplóides que se fundiram. Nos casos em que os dois domínios retêm parentaisuma cor distinta, o equilíbrio dos marcadores (GFP citoplasmática, mCherry marcadas polissomas) estava incompleta. Time-lapse estudos em curso mostram que redistribui GFP solúveis antes polissomos. Clique aqui para ver maior figura .

Legends suplementares

S1 figura. Fluorescência de células haplóides Extrema esquerda:. Células expressando polissomas mCherry-marcadas foram examinadas para detectar um sinal verde. A janela rectangular foi ajustado para evitar que as células negativas. Gráfico Médio: Células expressando GFP citosólica foram analisados, mostrando a população distintamente brilhante importante de aspectos positivos. Extrema direita: Células expressando polissomos mCherry-marcadas foram analisadas. O rectângulo (idêntico ao do extremo esquerdo) inclui as células brilhantes e permite que todosnegativos devem ser evitados. A designação "R2" indica a percentagem de células recuperadas no interior do rectângulo indicado.

Figura S2. Distribuição das células na primeira e segunda classificação. Estes gráficos de duas cores indicam a proporção de verde + vermelho + células no quadrante superior direito (R5). Essa proporção aumenta para 52% no segundo tipo. Eixo horizontal: sinal verde. Eixo vertical: sinal vermelho.

Discussão

A disponibilidade de zigotos purificadas deve facilitar estudos bioquímicos incluindo transcriptômica, proteômica e lipidómica, bem como de investigação de mecanismos pelos quais se submetem zigotos ciclo celular re-entrada, remodelamento da parede celular, características de brotamento e de herança, etc Alternativamente, os zigotos podem ser gerados a partir com estirpes de portadores de mutações características em um ou ambos os pais. Além disso, os zigotos purificados, assim como para células haplóides ou diplóides, ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente / Equipamento	Fonte	Número de Catálogo
pEG220, URA3/YIp, codificando GFP citoplasmática 11)	E. Grote
pAJ1661, URA3/CEN, codificação RPL25 fundido a mCherry	A. Johnston
Fisher sonicador FB120	Fisher Scientific
Tubo de polipropileno com filtro tampa	BD Falcon	Ref 352235
Microcentrífuga refrigerada	Tomy	MRX-150
Fluxo da solução bainha citometria	Biosure	1027
Reflexão ICYT citômetro de fluxo modelo	Sony
DeltaVision microscópio deconvolução	P aplicadorecision
Microscópio de epifluorescência ereta	Leica
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-07
Formulação de glucose CSM Notas: Para placas de agar, simplesmente incluir 2% de agar (Difco)	10