Heterotípica tridimensional In Vitro Modelagem de Estroma-epitelial de ovário Interações durante o início e progressão do câncer

Resumo

Descrevemos metodologias para estabelecer In vitro Heterotípicas modelos tridimensionais compreendendo fibroblastos de ovário e de superfície do ovário normal ou células ovarianas cancerosas epiteliais. Discute-se o uso desses modelos para estudar estromal-epiteliais interações que ocorrem durante o desenvolvimento do câncer de ovário.

Resumo

Câncer epitelial de ovário (EOCs) são a principal causa de morte por neoplasia ginecológica nas sociedades ocidentais. Apesar dos avanços em tratamentos cirúrgicos e melhoradas baseadas em platina quimioterapias, houve pouca melhora nas taxas de sobrevivência do EOC por mais de quatro décadas ^1,2. Enquanto tumores estádio I têm taxas de sobrevida em 5 anos> 85%, as taxas de sobrevivência para a fase III / IV doença são <40%. Assim, as elevadas taxas de mortalidade para EOC pode ser significativamente reduzida se os tumores foram detectados em anteriores, mais tratáveis, etapas ^3-5. Neste momento, a base molecular genética e biológica da fase inicial de desenvolvimento da doença não é bem entendido. Mais especificamente, pouco se sabe sobre o papel do microambiente do tumor durante a iniciação, mas factores de risco conhecidos para EOCs (por exemplo, idade e paridade) sugerem que o microambiente desempenha um papel essencial na génese precoce de EOCs. Por isso, desenvolveu modelos tridimensionais heterotípicostanto de ovário normal e dos cânceres de ovário em estágio inicial. O ovário normal, que co-cultivadas superfície de ovário epitelial (Iosé) e de fibroblastos do estroma normais (INOF) células, imortalizado por transdução retrovrial da subunidade catalítica da holoenzima telomerase humana (hTERT) para prolongar o tempo de vida das células em cultura. Para modelar as primeiras fases da transformação da célula epitelial do ovário, a superexpressão do oncogene nas células CMYC Iosé, de novo co-cultivadas com células INOF. Estes modelos heterotípicas foram utilizados para investigar os efeitos do envelhecimento e a transformação em senescência e invasão de células epiteliais. Aqui descrevemos os passos metodológicos no desenvolvimento destes modelo tridimensional; estas metodologias não são específicos para o desenvolvimento de ovário normal e tecidos de cancro do ovário, e pode ser usado para estudar outros tipos de tecidos em que as interacções de células estromais e epiteliais são fundamentais aspecto da manutenção dos tecidos e didesenvolvimento Sease.

Protocolo

A Figura 1 ilustra uma vista geral do fluxo de trabalho descritos a seguir.

1. Isolamento de fibroblastos normais de ovário e de extensão de Lifespan in vitro por superexpressão da subunidade catalítica da holoenzima hTERT

1. Tecidos ovarianos podem ser coletadas com consentimento informado do doente e aprovação do Conselho de Revisão Institucional (para instituições dos EUA). Tecidos ovarianos normais pode ser recolhida após histerectomia abdominal total ou histerectomia laparoscópica total com salpingo-ooforectomia bilateral. Neste estudo, os tecidos foram examinados por um patologista e uma porção do estroma ovariano biópsia para cultura de células. As amostras de tecido de cerca de 2-5 mm ² foram colhidos a partir da região central do ovário para tentar reduzir a probabilidade de amostragem também epitélio do ovário.
2. Transportar o tecido ovariano fresco para o laboratório de cultura de células de ovário de fibroblastos imortalizada normal (INDE) de meio de crescimento suplementado com antibióticos e antimicóticos extras. INOF meio de crescimento (GM-INOF) compreende: Meio 199 e MCDB105 misturadas numa proporção de 1:1, suplementado com 15% de soro fetal de bovino, 2 mM L-glutamina, 50 ug / ml de gentamicina e 250 ng / ml de anfotericina B.
3. Trabalhar no interior de um armário de biossegurança: Remover quaisquer células epiteliais que permanecem fracamente ligados ao tecido, através de lavagem da amostra com 5 ml de PBS. Aspirar e repetir mais duas vezes.
4. Transfira a amostra mais em PBS cm de diâmetro limpo 10 (P100) placa de cultura. Use uma pinça estéril para manipular o tecido e em lugar de um segundo prato de cultura, seca P100 limpo. Use bisturi estéril para cortar tecido 0,5 cm ² peças. Colocar cada peça de tecido em um prato P100 separada e corte em pedaços mais <1 mm ² de tamanho. Adicionar 20 ml INOF-GM (acrescido de antibióticos e antimicóticos) e incubar a 37 ° C, 5% CO _2. Monitorizar o crescimento celular utilizando microscopia de fase. As células podem ser vistos aderindo à sagacidade prato him de 24 horas.
5. Re-alimentação depois de uma semana, a remoção de qualquer tecido não aderente por aspiração. Depois disso, as culturas refeed duas vezes por semana. Células vão formar colônias, geralmente dentro de 1-3 semanas. Uma vez que estas colónias são grandes o bastante para subcultura (uma vez que eles atingem cerca de 500 mm), isolar os clones que utilizam discos revestidos de tripsina de clonagem.
   Confirmar as células são 100% fibroblástica e livre de outros contaminantes celulares por plaqueamento de uma amostra da linha de células em lamelas de vidro e efectuar imuno-coloração fluorescente por um marcador fibroblástico (FSP), um marcador epitelial (pan-citoqueratina) e um marcador de células endoteliais (von Willenbrand Factor VIII).
6. Passagem primário normal, ovário fibroblastos celular (NOF) isoladas de um prato único P100 P100 em 3 pratos um dia antes da transdução retroviral de hTERT. Pré-fabricados sobrenadantes virais podem ser comprados, ou produzido internamente utilizando protocolos padrão para as células co-transfecção HEK293T (vertarget = "_blank"> www.stanford.edu/group/nolan/).
   Os sobrenadantes retrovirais podem ser produzidos utilizando o vector pBABE-higro-hTERT (Addgene). Remover NoFS da incubadora e depois aspirar o meio de cultura celular. Adicionar 3 ml de sobrenadante virai para cada prato: um prato recebe hTERT retrovírus, o prato ^nd 2 recebe GFP-retrovirus e o terceiro prato recebe nenhum vírus. Sobrepor os sobrenadantes virais com INOF-GM contendo polibreno a uma concentração final de 8 ug / ml. Re-alimentação no dia seguinte as células com meio fresco. Dois dias após a infecção, começar com uma dose baixa de selecção (10 U / ml) de higromicina B. Após sete dias, esta dose pode ser aumentada para 20 U / ml, a selecção deve ser completa dentro de 10-14 dias.
7. Os clones que expressam GFP hTERT ou pode ser isolado por clonagem de anel, uma vez que chegar a cerca de 500 um. As linhas celulares requerem a caracterização adicional para confirmar a expressão bem sucedida de hTERT e de retenção das características das linhas de células primárias. Isto envolve: (a)confirmam a actividade da telomerase através de PCR-ELISA e do comprimento dos telómeros, por Southern blot ou PCR ^6,7, (b) confirmar a expressão de marcadores críticos (por exemplo, a imunocoloração com um anticorpo anti-pan-citoqueratina para identificar as células epiteliais, e com um anti- fibroblastos anticorpo para a proteína de superfície de fibroblastos) são semelhantes entre as células primárias e hTERT-imortalizadas, (c), confirmando que as células não apresentam propriedades de transformação neoplásica (por exemplo, usando ensaios de crescimento de ancoragem independentes), (d) a extensão confirmando in vitro de vida útil observado no células que expressam. hTERT, mas não GFP hTERT-expressando imortalizadas de fibroblastos normais de ovário (INOFs) deve ignorar a senescência replicativa, mas não se neoplastically transformada; adicionalmente as células INOF deve manter a expressão da proteína de superfície de fibroblastos, mas não os marcadores epiteliais como citoqueratina (Figura 2) .

2. Revestimento de tecido CulturPratos E com PolyHEMA para Não-aderente Cultura de Células

1. Para preparar a solução polyHEMA, pesar 1,5 g polyHEMA, e coloque em um frasco estéril. Adicionar 95 ml de etanol de grau de biologia molecular absoluto e 5 ml de água de grau de cultura de células destilada. O hidrogel polyHEMA se dissolverá no teor de água da solução e do etanol vai esterilizar a preparação.
2. Coloque a solução polyHEMA em banho-maria a 65 ° C até estar completamente dissolvido. Isso pode levar até oito horas. Note-se que a solução polyHEMA não pode ser armazenada por longos períodos de tempo e por isso deve ser sempre preparada.
   PROBLEMAS: Soluções de polyHEMA requerem longos períodos de incubação a 65 ° C. Regularmente inverter a solução polyHEMA para misturar. Viscosidade observado na parte inferior do frasco de vidro indica a polyHEMA não é totalmente dissolvido e posterior incubação a 65 ° C é necessária.
3. Trabalhar dentro de uma câmara de fluxo laminar, pratos de cultura de tecido do revestimento com a solução polyHEMA. Qualquer size do prato de cultura de tecidos, frasco ou placa com múltiplas cavidades podem ser revestidos com polyHEMA. Volumes recomendadas de solução polyHEMA necessária para cada navio são dados na Tabela 2.
4. Permitir que os pratos de cultura de células para secar no interior do exaustor de fluxo laminar. Isto pode demorar 2-3 dias. Agitação suave numa plataforma de agitação pode ser utilizada para assegurar uma camada de maiores dimensões pratos ou frascos. Se a secagem da solução polyHEMA muito rápido a superfície não pode ser lisa. Para evitar isso, assegurar a tampa do prato / balão permanece ao longo de todo o processo de secagem.
5. Aplicar uma segunda camada de polyHEMA e deixar secar, tal como descrito acima.
   PROBLEMAS: Furos no revestimento polyHEMA pode ocorrer, especialmente quando as placas secar demasiado depressa. Duplo-revestimento das placas com polyHEMA ajuda a preencher lacunas ou fissuras no revestimento são cobertos antes da utilização. Placas normalmente levam 2-3 dias para cada revestimento polyHEMA para secar e por isso deve ser preparada, pelo menos, uma semana antes de serem necessários para a cultura de células.
6. PolyHEMA placas revestidas podem ser armazenadas à temperatura ambiente até à sua utilização.

NOTA: 1% de agarose de soluções, dissolvido em PBS 1X e autoclavado para esterilizar, pode também ser utilizado para revestir os pratos de cultura de células para criar uma superfície não aderente para a cultura a curto prazo em 3D (menos de uma semana). Agarose revestimento de multi-poços cria uma superfície côncava que promove a formação de um único esferóide por poço de muitas linhas celulares. No entanto, para as culturas mais 3D revestimento polyHEMA é recomendada como agarose revestimento muitas vezes desintegra-se após períodos prolongados de cultura.

3. Gerando tridimensionais (3D) Spheroids heterotípica e re-alimentação de culturas 3D

1. Recuperar e expandir as culturas de células epiteliais e INOF in vitro para preparar células suficientes para estabelecer 3D esferóides heterotípicos. Para a 'cultura de massa' nós semente tipicamente 2 ^4x10-6 por INOFs P100 prato e 0,5-1x10 ⁶ células epiteliais para dar uma estromal: ra epitelialTio de 4:1. INOF células são cultivadas em meio de crescimento INOF (INOF-GM) sem gentamicina ou a anfotericina B. Se se desejar, as células de fibroblastos pode ser pré-tratado antes da cultura em 3D (por exemplo, para a indução da senescência, as células podem ser tratadas com doses sub-letais de peróxido de hidrogénio ).
2. Lavar a placa polyHEMA seco com 5 ml de salina tamponada com fosfato (PBS) durante 5 min. Aspirar o PBS e substituir com 15 ml INOF-GM.
3. Enquanto isso, Tripsinizar imortalizada fibroblastos normais de ovário de destacá-las a partir da placa de cultura, depois de 3-5 min neutralizar a tripsina com um volume igual de meios de cultura e sedimentar as células por centrifugação a 450 xg durante 5 min.
4. Descartar o sobrenadante. Criar uma suspensão de células individuais por ressuspensão do sedimento celular em 5 ml INOF-GM, misturar bem, pipetando para cima e para baixo ou vortex suavemente. Determinar a concentração de células por mistura de 10 ul de suspensão de células a 10 uL de azul de tripano e enumerar utilizando um hemocitómetro. Trypan exclusão azul pode ser usard para identificar as células vivas.
5. Adicionar células 4x10 ⁶ INOF ao meio já aplicada no prato polyHEMA revestido. Perfazer o volume de cultura de meio de 20 ml utilizando um volume adequado de fresco INOF-GM e incubar a 37 ° C, 5% CO _2. Células começam a agregar-se em esferóides multicelulares dentro de 24 horas. Formação esferóide pode ser monitorizada por microscopia de fase.
   Contagem precisa do número de esferóides em condições de cultura de massa, é difícil, mas a estimativa é que obtemos 50-100 esferóides quando 4x10 ⁶ células do estroma são banhados. Esferóides tamanhos variam tipicamente 80-250 | im.
6. Realimentar as culturas esferóides a cada 2-3 dias por repousar as placas num ângulo de uma pipeta colocado dentro da câmara de fluxo laminar. Permitir que os esferóides para resolver. Isso pode levar até 20 minutos. Cuidadosamente remover os meios esgotados com uma pipeta de 5 ml, até que apenas cerca de 4 ml permanecem no prato. Tome cuidado para não aspirar o esferóides. Re-alimentação com 16 ml fresco INOF-GM e voltar para a incubadora.
7. No dia 7, as células epiteliais para adicionar esferóides de fibroblastos para criar culturas heterotípicas como se segue. Preparar suspensões de células epiteliais do ovário (fenotipicamente normais ou transformadas) por tripsinização, tal como descrito na secção de 3,4-3,5. Determinar a concentração de células utilizando um hemocitómetro. Lave uma vez no INOF-GM para evitar fatores de crescimento de serem transitadas os meios de crescimento epiteliais.
   Em nosso laboratório, a superfície ovariana normal das células epiteliais (OSEC) linhas foram coletadas com consentimento informado do doente de ovários removidos por histerectomia abdominal total ou histerectomia laparoscópica total com salpingo-ooforectomia bilateral. Os ovários foram escovados com uma cytobrush estéril para recolher o epitélio. Linhas de células primárias foram estabelecidas e transduzidas com hTERT utilizando a abordagem descrita acima. Detalhes da cultura OSEC em 2D, 3D e imortalização OSEC podem ser encontradas nas referências 10 e 11.
8. Para formar sph heterotípicaeroids, primeiro re-alimentação culturas de fibroblastos esferóides sozinho. Então inocular culturas de fibroblastos esferóides com 1x10 ⁶ células epiteliais, na proporção de 04:01 de fibroblastos, células epiteliais. Cultura dos esferóides heterotípicas, INOF-GM.
9. Re-alimentar heterotípicas culturas a cada 2-3 dias durante mais 14 dias.

4. Processamento de Imagem e Análises moleculares

1. Muitas técnicas diferentes podem ser usadas para analisar os esferóides heterotípicas. Para imagiologia, recomenda-se que esferóides são colhidas a partir do prato de cultura com uma pipeta de 25 ml. Pipetagem lentamente irá minimizar as chances de forças de cisalhamento perturbar a arquitetura do esferóide. Esferóides podem então ser lavadas com PBS e sedimentadas por centrifugação a 100 gentilmente xg durante 10 min; forças centrífugas superiores podem danificar os esferóides. Como alternativa, as culturas podem ser transferidos para um tubo de 50 ml Falcon e deixada em repouso, o meio de crescimento e, em seguida, removida.
   1. Para imunoquímica, corrigir esferóides com formol neutro tamponado por 30 minutos em temperatura ambiente. Pellet os esferóides e substituir a formalina, com etanol a 70%. Processo em parafina, utilizando protocolos normalizados utilizados para os tecidos humanos. Esferóides embebidas em parafina podem ser seccionados e corados com hematoxilina e eosina ou ou marcadores moleculares específicos usando imuno-histoquímica padrão (Figura 3).
   2. Alternativamente, esferóides lavadas em PBS pode ser fixado em paraformaldeído a 4% (preparado em PBS), incorporado no meio de corte ideal de temperatura e pressão outubro congelado para seccionamento congelado e coloração imunofluorescente.
2. Para análises moleculares, os esferóides podem ser colhidas, sedimentadas e lavadas duas vezes em PBS antes da lise das células de DNA, RNA ou proteínas.
3. Para a análise por citometria de fluxo, esferóides podem ser lavadas em PBS e dissociadas por digestão com tripsina ou Accutase a 37 ° C. Para fazer isso, submergir o tubo de Falcon contendo esferóides ind banho de água para facilitar a tripsinização. Dissociação completa de esferóides numa única suspensão de células pode ser promovida por pipetagem da solução de cima e para baixo com uma ponta de pipeta de 1 ml. Tome cuidado para não sobre-Tripsinizar as células.

Neutraliza-se a reacção com igual volume de meio de cultura e remover aglomerados de células fazendo passar a suspensão através de um filtro de células 40-70 ^ m. Células de pelotas, lavar com PBS, enumerar e ressuspender o número desejado de células em tampão de SCAF. Corar as células de acordo com as instruções dos fabricantes.

5. Resultados representativos

Esta abordagem pode ser utilizada para uma vasta gama de aplicações, e para o estudo da biologia do ovário normal, assim como o estudo da iniciação do cancro do ovário. Uma grande vantagem deste método em relação as culturas 3D criados usando gel matriz extracelular disponível comercialmente é que os fibroblastos normais de ovário produzem a matriz extracelular que torna up o núcleo dos esferóides. Na nossa experiência, o material da matriz produzida pelos fibroblastos normais de ovário é heterogénea e mais se assemelha a matriz extracelular do ovário do que qualquer gel de matriz comercialmente disponível. No nosso laboratório, utilizamos células epiteliais que foram parcialmente transformadas in vitro utilizando elementos genéticos definidos (por exemplo, a superexpressão CMYC) e co-cultivadas com estas células fibroblastos de ovário normal e senescente imitar primeiras fases do cancro do ovário de um ovário de pós-menopausa. Os nossos dados sugerem que o microambiente do envelhecimento promove características neoplásicas (por exemplo, a proliferação) de células epiteliais parcialmente transformadas (Figura 3), ao passo que o microambiente normal, inibe a progressão neoplásica ^8. Nosso laboratório e outros também têm usado abordagens semelhantes para modelar células ovarianas epiteliais normais ^9, células epiteliais, tuba uterina passo a passo modelos de progressão neoplásica 11-13 como homotípicas culturas esferóide. Observou-se que as características histológicas de células normais e malignas que não são detectáveis ​​quando as células são cultivadas como monocamadas são restaurados quando as células são transferidos para cultura esferóide. Por exemplo, as características histológicas de cancros do ovário claras de células podem ser detectadas em culturas de células claras 3D de linhas celulares de cancro do ovário (Figura 4), ​​mas não em culturas de monocamada das mesmas células. Além disso, células cultivadas em 3D de forma mais estreita reflectir a expressão da proteína específica do tecido observada em tecidos primários em comparação com as mesmas células cultivadas em culturas em monocamada tradicionais 2D ^9-11. Estas abordagens para modelagem normal e tecidos ovarianos malignos também representam ferramentas valiosas para a descoberta e análise funcional de novos candidatos de cancro do ovário genes supressores de tumores e de oncogenes e outros biomarcadores moleculares que podem estar associados com diSease desenvolvimento ^10,14.

Figura 1. Visão esquemática do protocolo para a cultura heterotípica 3D. Frascos de cultura de tecidos são duas vezes revestido com uma solução polyHEMA 1% e deixadas a secar. Plásticos PolyHEMA revestidas são lavadas com 1x PBS imediatamente antes da utilização. Imortalizadas células ovarianas normais de fibroblasto (4x10 ⁶ células) são plaqueadas para o balão com 20 ml de meio de crescimento. Esferóide formação e crescimento monitorado ao longo de 7 dias. Neste ponto, as culturas de fibroblastos esferóides são inoculadas com 1x10 ⁶ células epiteliais, e os dois tipos de células são co-cultivadas durante 14 dias antes dos esferóides multicelulares são colhidas e processadas para aplicações a jusante (análises moleculares, imagem, etc.)

Figura 2. A coloração por imunofluorescência de hTERT </ Em> imortalizado fibroblastos ovarianos normais. Ambos os fibroblastos primários ovarianos normais (Pr NoFS) e imortalizado fibroblastos ovarianos normais (INOFs) expressar a proteína específica de fibroblastos (FSP), não expressam citoqueratina-7 (Ck-7) e expressam vimentina (VIM) . Marcadores de interesse são mostrados em verde, o DNA é corado com DAPI e mostrado em azul, citoplasma é contrastado com o azul de Evan e mostrado em vermelho.

Figura 3. Imunohistoquímica de co-cultura de células do estroma e epitelial. Painel esquerdo, normal do ovário monocultura esferóide fibroblastos, corados pelo HE. Células de fibroblastos normais de ovário cultivados sozinhos em esferóides de forma 3D consistindo de células com uma morfologia fusiformes e matriz extracelular abundante. Painel direito: fibroblastos normais ovarianos foram expostas a peróxido de hidrogénio a induzir a senescência. Parcialmente transformadas células epiteliais do ovário (Iosé ^cmyc significativamente mais do que as mesmas células submetidos à indução de senescência (pré-seca, a PSN). Pais células Iosé sem superexpressão CMYC não mostram diferenças na proliferação quando co-cultivados com a PSN ou fibroblastos NEE. Estes dados sugerem queno nosso modelo in vitro de co-cultura, os processos de envelhecimento no estroma ovariano pode promover o desenvolvimento de contraceptivos orais ^11. * P ≤ 0,05, bicaudal teste t pareado.

Figura 4. Características histológicas de células em cultura em 3D reflectir tecidos primários. (A) células de carcinomas do ovário Limpar exibir características de estruturas de células claras, estes estão ausentes quando as linhas de células claras EOC são cultivadas em estruturas de plástico, mas semelhantes são detectados quando as mesmas células são crescidas como esferóides 3D ( B). (C) micrografia eletrônica de varredura de células ovarianas epiteliais normais cultivadas como esferóides por 14 dias. Microvilos na superfície são visíveis (setas). (D) do cancro do ovário seroso esferóides de linha de células, em cultura. (A, B) coloração de hematoxilina e eosina de parafina seccionado incorporado tecido tumoral ou esferóides 3D, (C) microscopia electrónica de varrimento, (D) A microscopia de contraste de fase. Esferóides podem ser esférica (círculo tracejado)ou irregulares na forma, como no caso da estrutura de visto no lado esquerdo da imagem.

Prato / placa tamanho	Volume de PolyHEMA (a ser aplicado duas vezes)	Volume cultura de mídia final
Placa de 6 poços	3 ml	Ml 5-7
Placa de 12 poços	1,5 ml	2 ml
Placa de 24 poços	500 ul	1,5 ml
Placa de 48 poços	250 ul	500 ul
Placa de 96 poços	50 ul	200 ul
P100 prato de cultura	4-5 ml	20 ml
P60 prato de cultura	2-3 ml	Ml 5-7
F25 frasco	2-3 ml	7 ml
F75 frasco	4-5 ml	20-30 ml
F175 frasco	15 ml	30-50 ml

Tabela 2. Recomendado para polyHEMA volumes de revestimento e de cultura 3D.

Discussão

A biologia da fase precoce de câncer epitelial de ovário (EOC) é mal compreendida. Talvez um dos principais impedimentos na matéria, durante muitos anos tem sido a falta de compreensão das origens de tecidos específicos da doença, e da importância do papel do microambiente no desenvolvimento AOE. Ao longo dos últimos anos, é tornou-se claro que EOC é uma doença heterogênea, com vários subtipos distintos histophathological, provavelmente com diferentes origens celulares para diferentes subtipos. Por exemplo, os dados act...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagente	Fornecedor	Número de Catálogo
PolyHEMA, adequado para cultura de células	Sigma Aldrich	P3932
Etanol de grau de biologia molecular	Sigma Aldrich	E7023
Água estéril para cultura de células	VWR	12001-356
MCDB105	Sigma Aldrich	M6395
Meio 199	Sigma Aldrich	M2154
Soro fetal de bovino Hyclone	Thermo Scientific	SH30088.03
Gentamicina	Sigma Aldrich	G1397
A anfotericina B	Sigma Aldrich	A2942
pBABE-higrômetro-hTERT	Addgene	1773
PBS	VWR	12001-766
0,25% de tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-072
Célula filtro (40 ou 70 mm)	VWR	21008-949 21008-952
Anti-anticorpo de fibroblastos proteína de superfície, clone 1B10	Sigma	F4771
Anti-pan-citoqueratina anticorpo (C11)	Santa Cruz	sc-8018
Polybrene (brometo Hexadimetrina)	Sigma	107689
TeloTAGGG telomerase PCR ELISA PLUS	Roche	12013789001
TeloTAGGG Ensaio comprimento dos telômeros	Roche	12209136001