Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

Resumo

O transplante de medula óssea oferece uma maneira de alterar o genótipo de células derivadas de medula óssea. Se o gene de interesse é expresso em ambas as células de medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivados, transplante de medula óssea pode mudar as células de medula óssea derivadas de um genótipo diferente sem alterar a non-bone marrow genótipo celular derivada.

Resumo

Para compreender o papel de um gene no desenvolvimento de colite, foram comparadas as respostas dos ratinhos de tipo selvagem e gene-de-interesse camundongos knockout para deficientes colite. Se o gene de interesse é expresso em ambas as células de medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivadas do hospedeiro, no entanto, é possível distinguir a função de um gene de interesse em células de medula óssea e não derivadas de medula óssea células derivadas pela técnica de transplante de medula óssea. Para alterar o genótipo de medula óssea derivada de células de ratos, a medula óssea original de ratinhos receptores foram destruídas por irradiação e, em seguida, substituído por medula óssea de dador novo genótipo diferente. Quando ratinhos do tipo selvagem da medula óssea do dador foi transplantado para ratos knockout, podemos gerar ratinhos knockout de tipo selvagem, com a expressão de genes em células da medula óssea derivadas. Alternativamente, quando ratinhos knockout de medula óssea do dador foi transplantado para ratos do tipo selvagem destinatário, ratinhos de tipo selvagem, sem gene de interesse que expressama partir de células de medula óssea derivadas foram produzidos. No entanto, o transplante de medula óssea pode não ser 100% completa. Portanto, utilizou-se aglomerado de diferenciação (CD) moléculas (CD45.1 e CD45.2) como marcadores de células do doador e do receptor para controlar a proporção de medula óssea do dador de células derivadas de ratinhos receptores e do sucesso do transplante de medula óssea. Ratinhos de tipo selvagem com CD45.1 ratos knockout com genótipo e CD45.2 genótipo foram utilizados. Após a irradiação dos ratos receptores, as células de medula óssea de dadores de diferentes genótipos foram infundidos nos ratinhos receptores. Quando a medula óssea novo regenerado para assumir a sua imunidade, os animais foram desafiados por agente químico (dextran sulfato de sódio, 5% de DSS) para induzir a colite. Aqui também mostraram que o método para induzir a colite em ratos e avaliar o papel do gene de interesse expresso a partir de células da medula óssea derivadas. Se o gene de interesse, a partir de células de osso derivadas desempenha um papel importante no desenvolvimento da doença (tal como E. colitis), o fenótipo dos ratinhos receptores de transplante de medula óssea pode ser significativamente alterada. No final das experiências de colite, a medula óssea derivadas de células no sangue e na medula óssea foram marcadas com anticorpos contra CD45.1 e CD45.2 e a sua razão quantitativa de existência pode ser utilizada para avaliar o sucesso do transplante de medula óssea por citometria de fluxo. O transplante de medula óssea de sucesso deve mostrar uma grande maioria dos genótipo doador (no termo do marcador CD molécula) ao longo de genótipo receptor, tanto na medula óssea e no sangue de ratos receptores.

Protocolo

1. Antes-de-começar Considerações Técnicas

1. Recomendamos o uso de ambos os C57/BL6 camundongos selvagens e camundongos knockout para o experimento porque os ratos com moléculas de CD correspondentes pode ser comprado de fornecedores do mouse principais.
2. Uma vez que é difícil controlar os ratinhos do tipo selvagem e ratinhos knockout derivadas de células dadoras após transplante de medula óssea, é necessária a utilização de ratinhos CD45.1 para representar ratinhos de tipo selvagem. (CD45.1 C57/SJL WT ratos Jackson estoque Laboratories # 002014).
3. A maioria das colônias do rato são CD45.2. Camundongos knockout nossas pertencem a CD45.2 genótipo (alternativamente uma fonte CD45.2 ratinhos WT: Jackson Laboratories stock # 000664). A determinação do CD45.1 ou CD45.2 genótipo pode ser realizada por citometria de fluxo de medula óssea e sangue periférico, como mencionado na seção 7 deste protocolo.
4. Camundongos após irradiação ter comprometido a imunidade. Mantenha ratos em instalação livre de patógenos.
5. Operação de irradiador requer especial de segurança clearance e treinamento. Para economizar tempo nos processos de formação e aprovação, o melhor é colaborar com um laboratório com técnico qualificado que é capaz de operar o irradiador.
6. Muitas instituições têm laboratórios de citometria de fluxo com técnicos experientes. Para minimizar problemas com a operação de citometria de fluxo, é melhor discutir o seu fluxo de citometria de plano experimental com o técnico experiente antes de começar.
7. Os ratos foram atribuídos desta maneira (10 ratos por grupo):

Grupo		Doador de medula óssea para o destinatário	Tratamento
A	BM troca	CD45.1 WT para CD45.2 KO	DSS colite
B			Controle normal de água
C	BM troca	CD45.2 KO para CD45.1 WT	DSS colite
D			Controle normal de água
E	Impostura	CD45.1 WT para CD45.1 WT	DSS colite
F			Controle normal de água
G	Impostura	CD45.2 KO para CD45.2 KO	DSS colite
H			Controle normal de água

* Uma breve ilustração do protocolo experimental é apresentado na Figura 1.

2. Irradiação Mice destinatário

1. Ratos são criados e mantidos em instalações livres de agentes patogénicos. Coloque em ratos torta irradiação autoclavado com filtro. Coloque um rato em cada slot de torta de irradiação. Coloque a torta para o irradiador e certifique-se o prato e torta estão girando.
2. Ligue a bomba de arpara ventilação. Feche a porta do irradiador e bloqueá-lo.
3. Irradiar os murganhos com 1000 rad (o qual é equivalente a 10 Gy) em torno de 10 minutos (dependendo da fonte de radiação e de semi-vida). A partir deste ponto de tempo, os ratinhos irradiados são imuno-comprometidos e têm fraca imunidade contra a infecção. Após a irradiação, leve a torta para fora e colocar em um recipiente estéril para o transporte de biossegurança gabinete em instalações para animais. Evitar expor os ratos ao ambiente externo para minimizar a possibilidade de infecção.
4. Em biossegurança gabinete, transferir os ratos em gaiolas de rato autoclavados com cama autoclavado (4 ratos por gaiola Adicionar água estéril novo com suspensão sulfatrim -. 3,12 ml por 100 ml de água).
5. Enrole a garrafa de água com uma folha de alumínio como os antibióticos são sensíveis a luz. Agite para misturar o frasco da solução sulfatrim bem antes de carregá-lo para a jaula.

3. Extracção doador de medula óssea

1. Sacrificar os ratos com dióxido de carbono ou isoflurdade e, em seguida, mergulhe em 1:200 solução desinfetante. Pulverizar os ratos com etanol a 70%, para molhar a pele e dissecar ossos abertos.
2. Mergulhe os instrumentos de dissecção em etanol de 70% para a esterilização.
3. Realizar a dissecação em um armário de biossegurança. Use os instrumentos de dissecção estéreis para expor o úmero, fêmur, tíbia e fíbula ossos, livre de fixar os músculos e ligamentos.
4. Cortar abrir ambas as extremidades dos ossos para mostrar a medula óssea vermelha. Manter os ossos com uma pinça. Lave a medula óssea vermelha com PBS frio, com seringa de 3 ml e agulhas 25G para uma placa de Petri. Lave a partir de ambas as extremidades dos ossos, para se obter as células da medula óssea mais.
5. Use 6 seringas ml e 18G1 / 2 agulhas para quebrar plugues de medula óssea vermelha por aspiração repetida e ejeção. Transferência de medula óssea com tubos de 50 ml Falcon.
6. Girar a medula óssea para baixo em 1800 rpm durante 5 min a 4 ° C. Elimine o sobrenadante, ressuspender pellet em vortex por 5-10 segundos.
7. Diluir 10X de tampão de lise de RBC com água estéril. Anúnciod 1X tampão de lise (5 ml por rato doador), vortex novamente durante 5 segundos e manter exactamente 3 minutos à temperatura ambiente.
8. Após 3 min, encher os tubos com 20 ml de PBS frio para parar a lise e mistura-se. Despeje o conteúdo através de um filtro de células 40 mM diretamente em um novo tubo de 50 ml Falcon.
9. Enxaguar os tubos originais com 5 ml de PBS e transferir para o coador de células também. Ateste para 50 ml com PBS e agitar.

4. Contagem de células de doadores de medula óssea

1. Adicionar 100 ul de azul de tripano a um tubo Eppendorf a 100 ul de suspensão de medula óssea, para um tubo de Eppendorf e misturar. Pipetar a mistura de células coradas com um hemocitómetro.
2. A quantidade de células é calculado através da contagem de células totais vivo de medula óssea em tubos Falcon = número de células não coradas em 16 quadrados x 2 (devido a diluição azul de Trypan) x 10,000 x 50 ml
3. Girar as células da medula óssea, em tubos de 50 ml Falcon a 2.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
4. Remover o sobrenadante. Baseadosobre as contagens de células totais, ressuspender o pellet com PBS a 1 x 10 células por ml ⁸

5. Infusão de ratinhos receptores

1. Aqueça os ratos receptores sobre uma almofada de calor e sob uma lâmpada de aquecimento. Coloque os ratos beneficiários no limitador. Injectar 1 x 10 ⁷ células por rato em 100-200 ul por via intravenosa.
2. Injecção de medula óssea do dador deve ser feita entre 4-24 horas após a irradiação.
3. Mantenha-se quatro camundongos injetados por gaiola. Manter os camundongos injetados destinatário em gaiolas autoclavados com água-tratamento por antibióticos nas primeiras 4 semanas em biotério patógeno livre e deixar os ratos recuperar a imunidade. Gaiolas de mudança, de água tratado com antibióticos e alimentos a cada 4 dias para manter a higiene.

6. Indução de colite e Avaliação de Colite

1. 4 semanas após a irradiação e transplante de medula óssea, mude para a água regular sem antibióticos e manter os ratos para mais 2 semanas para recuperar o seu normalgut microflora.
2. 6 semanas após a injeção de medula óssea, medir o peso corporal inicial. Alguns ratos recebem 5% de sulfato de dextrano em beber água ad libitum para induzir a colite. Alguns ratos são dadas água potável regular apenas como grupos de controle normais.
3. 5 dias depois, retirar o sangue periférico, a transferência para tubos revestidos de heparina (Vacutainer) e manter-se em gelo. A piscina do sangue de 4 ratos para um tubo. Combinar 300 ul de sangue com 300 ul de tampão de coloração de células = pi 600. Dividir o sangue para tubos Eppendorf 5, cada um com 100 ul.
4. Sacrificar os ratos com dióxido de carbono ou isoflurano. Avaliar os escores de danos macroscópicos (consultar a outra publicação vídeo JOVE para detalhes ^1). Medir variação de peso. Medida comprimento do intestino e espessura com paquímetro digital. Observe textura das fezes (duro, macio ou com sangue). Determine de sangue oculto nas fezes com Hemooccult. Dissecar tecidos do cólon e fixar em formol para a H & E coloração.
5. Dissecar um fêmur bone por rato, extrair medula óssea e lave a medula óssea com frio PBS através de agulha 25G e uma seringa ml. Piscina de medula óssea 4 fichas de um tubo e manter em gelo.
6. Despeje a medula óssea, para uma placa de Petri, a ficha de cisalhamento de medula óssea com uma agulha de 18G e 5 vezes ml seringa até vários nenhuma ficha medula óssea está presente.
7. Girar com 1.500 rpm durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante e ressuspender com 600 ul de tampão de coloração de células. Dividir a medula óssea ressuspenso em 5 tubos de Eppendorf, cada um com 100 ul.

7. Inspeção de Qualidade de Transplante de Medula Óssea por citometria de fluxo

1. Rotular cada tubos de amostras de sangue ou de medula óssea # 1-5:
2. Preparar a mistura de anticorpo para cada respectivo tubo no escuro.

# 1 Não anticorpo
# 2 30 ul de controlo de isotipo FITC + 30 uL de controlo de isotipo PE + 15 ul de bloqueio CD16/32
# 3 30 ul FITC CD45.1 Ab + 15 ul de bloqueio CD16/32
# 4 30 PE ulCD45.2 Ab + 15 ul de bloqueio CD16/32
# 5 30 ul de Ab FITC CD45.1 + 30 uL PE CD45.2 Ab + 15 ul de bloqueio CD16/32

Adicione nada a amostra de sangue ou de medula óssea # 1

Adicionar 5 uL de mistura de anticorpo # 2 para cada amostra de sangue ou de medula óssea # 2

Adiciona-se 3 uL de mistura de anticorpo # 3 para cada amostra de sangue ou de medula óssea # 3

Adiciona-se 3 uL de mistura de anticorpo # 4 para cada amostra de sangue ou de medula óssea # 4

Adicionar 5 uL de mistura de anticorpo # 5 para cada amostra de sangue ou de medula óssea # 5

3. Manter no escuro em gelo durante 30 min.
4. Adicionar 2 ml de 1X tampão de lise de glóbulos vermelhos para cada tubo. Manter no escuro em gelo durante 15 min.
5. Girar as células a 1500 rpm, 5 min a 4 ° C. (GH rotor 3.8, 1.500 rpm = 350 xg) Remover o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 500 ul de tampão de coloração de células no brevemente, em seguida escuro vortex.
6. Verifique a CD45.1 (representando WT) e CD45.2 (representando KO) no sangue imunologicamente e amostras de medula óssea por citometria de fluxo. Selecione FITC para representar WT CD45.1 e PE para representar KO CD45.2.
7. Analisar os resultados de citometria de fluxo por software FlowJo. Calcular a proporção de FITC: PE ou PE proporção: relação FITC para determinar se o genótipo doador é genótipo dominante no sangue e na medula óssea.

Resultados

Se o gene de interesse, desempenha um papel importante em células imunitárias durante o desenvolvimento de colite, os murganhos que receberam medula óssea de genótipo diferente através de transplante de medula óssea (WT KO ou KO para a WT) deve ter uma resposta alterada a colite DSS. Um dos parâmetros mais importantes para determinar a gravidade da colite é a coloração de H & E de tecidos do cólon. Alterações no tecido do cólon estrutura e sinais de inflamação pode ser avaliado quantitativamente pela H & sistema...

Discussão

Este transplante de medula óssea abordagem é adequada para a pesquisa de imunologia colite, infecção, cancro, obesidade e outras doenças. Este transplante de medula óssea experimento é necessária quando o gene de interesse é expresso tanto na medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivados e o gene de interesse, se suspeita de mediar doença por células a partir de qualquer população. Por exemplo, o péptido antimicrobiano cathelicidin é mostrado para modular a colite aguda. Mas este é expresso em ambas as ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Tampão de coloração de células	Biolegend	# 420201
10X tampão de lise de RBC	Biolegend	# 420301
FITC rato isotipo controle	Biolegend	# 400207
PE rato isotipo controle	Biolegend	# 400211
PE anti-rato CD45.2	Biolegend	# 109807
FITC anti-rato CD45.1	Biolegend	# 110705
Anti-rato CD16/32 bloqueio	Biolegend	# 101301
40 filtro de células mM	Fisherbrand	# 22363547
PBS 1X	MP Biomedicals	# 1860454
Heparina	Fisherbrand	# BP2425
Sulfatrim (SMZ)	Qualitest	NC9242720 (Fisher)
Lysol IC	Andwin Científico	NC9745686 (Fisher)
Vaccutainer	BD	# 8000813
Rato limitador	Braintree Científica	# TV-150
Irradiador	JL Pastor e Associados	Mark I 68A
Citómetro	BD	BD FACSCanto II
Tubo de ensaio de fluxo citómetro	Falcão	# 352052
Paquímetro digital	Fisherbrand	14-648-17
Hemoccult TIC	Beckman Coulter	G0328QW