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Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

DOI:

10.3791/4208

October 1st, 2012

In This Article

Summary

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O transplante de medula óssea oferece uma maneira de alterar o genótipo de células derivadas de medula óssea. Se o gene de interesse é expresso em ambas as células de medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivados, transplante de medula óssea pode mudar as células de medula óssea derivadas de um genótipo diferente sem alterar a non-bone marrow genótipo celular derivada.

Abstract

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Para compreender o papel de um gene no desenvolvimento de colite, foram comparadas as respostas dos ratinhos de tipo selvagem e gene-de-interesse camundongos knockout para deficientes colite. Se o gene de interesse é expresso em ambas as células de medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivadas do hospedeiro, no entanto, é possível distinguir a função de um gene de interesse em células de medula óssea e não derivadas de medula óssea células derivadas pela técnica de transplante de medula óssea. Para alterar o genótipo de medula óssea derivada de células de ratos, a medula óssea original de ratinhos receptores foram destruídas por irradiação e, em seguida, substituído por medula óssea de dador novo genótipo diferente. Quando ratinhos do tipo selvagem da medula óssea do dador foi transplantado para ratos knockout, podemos gerar ratinhos knockout de tipo selvagem, com a expressão de genes em células da medula óssea derivadas. Alternativamente, quando ratinhos knockout de medula óssea do dador foi transplantado para ratos do tipo selvagem destinatário, ratinhos de tipo selvagem, sem gene de interesse que expressama partir de células de medula óssea derivadas foram produzidos. No entanto, o transplante de medula óssea pode não ser 100% completa. Portanto, utilizou-se aglomerado de diferenciação (CD) moléculas (CD45.1 e CD45.2) como marcadores de células do doador e do receptor para controlar a proporção de medula óssea do dador de células derivadas de ratinhos receptores e do sucesso do transplante de medula óssea. Ratinhos de tipo selvagem com CD45.1 ratos knockout com genótipo e CD45.2 genótipo foram utilizados. Após a irradiação dos ratos receptores, as células de medula óssea de dadores de diferentes genótipos foram infundidos nos ratinhos receptores. Quando a medula óssea novo regenerado para assumir a sua imunidade, os animais foram desafiados por agente químico (dextran sulfato de sódio, 5% de DSS) para induzir a colite. Aqui também mostraram que o método para induzir a colite em ratos e avaliar o papel do gene de interesse expresso a partir de células da medula óssea derivadas. Se o gene de interesse, a partir de células de osso derivadas desempenha um papel importante no desenvolvimento da doença (tal como E. colitis), o fenótipo dos ratinhos receptores de transplante de medula óssea pode ser significativamente alterada. No final das experiências de colite, a medula óssea derivadas de células no sangue e na medula óssea foram marcadas com anticorpos contra CD45.1 e CD45.2 e a sua razão quantitativa de existência pode ser utilizada para avaliar o sucesso do transplante de medula óssea por citometria de fluxo. O transplante de medula óssea de sucesso deve mostrar uma grande maioria dos genótipo doador (no termo do marcador CD molécula) ao longo de genótipo receptor, tanto na medula óssea e no sangue de ratos receptores.

Protocol

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1. Antes-de-começar Considerações Técnicas

  1. Recomendamos o uso de ambos os C57/BL6 camundongos selvagens e camundongos knockout para o experimento porque os ratos com moléculas de CD correspondentes pode ser comprado de fornecedores do mouse principais.
  2. Uma vez que é difícil controlar os ratinhos do tipo selvagem e ratinhos knockout derivadas de células dadoras após transplante de medula óssea, é necessária a utilização de ratinhos CD45.1 para representar ratinhos de tipo selvagem. (CD45.1 C57/SJL WT ratos Jackson estoque Laboratories # 002014).
  3. A maioria das colônias do rato são CD45.2. Camundongos knockout nossas pertencem a CD45.2 gen....

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Results

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Se o gene de interesse, desempenha um papel importante em células imunitárias durante o desenvolvimento de colite, os murganhos que receberam medula óssea de genótipo diferente através de transplante de medula óssea (WT KO ou KO para a WT) deve ter uma resposta alterada a colite DSS. Um dos parâmetros mais importantes para determinar a gravidade da colite é a coloração de H & E de tecidos do cólon. Alterações no tecido do cólon estrutura e sinais de inflamação pode ser avaliado quantitativamente pela H & sistema.......

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Discussion

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Este transplante de medula óssea abordagem é adequada para a pesquisa de imunologia colite, infecção, cancro, obesidade e outras doenças. Este transplante de medula óssea experimento é necessária quando o gene de interesse é expresso tanto na medula óssea e células derivadas de medula óssea não derivados e o gene de interesse, se suspeita de mediar doença por células a partir de qualquer população. Por exemplo, o péptido antimicrobiano cathelicidin é mostrado para modular a colite aguda. Mas este é expresso em ambas as .......

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Disclosures

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Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgements

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Este trabalho foi financiado pelo piloto e concessão Estudo de Viabilidade da UCLA-CURE Center, a Fundação de Crohn e Colite da América Prêmio de Desenvolvimento de Carreira (# 2691) e do Instituto Nacional de Saúde NIDDK K01 (DK084256) financiamento para Hon Wai Koon.

Óssea operação irradiação medula foi assistido por Bernard Levin e Cozinha Scott, da UCLA Center for AIDS Research Rato / instalação humanos fundamentais Quimera. Operação de citometria de fluxo foi assistida pela UCLA instalação Núcleo do vetor.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome do reagente Companhia Número de catálogo
Tampão de coloração de células Biolegend # 420201
10X tampão de lise de RBC Biolegend # 420301
FITC rato isotipo controle Biolegend # 400207
PE rato isotipo controle Biolegend # 400211
PE anti-rato CD45.2 Biolegend # 109807
FITC anti-rato CD45.1 Biolegend # 110705
Anti-rato CD16/32 bloqueio Biolegend # 101301
40 filtro de células mM Fisherbrand # 22363547
PBS 1X MP Biomedicals # 1860454
Heparina Fisherbrand # BP2425
Sulfatrim (SMZ) Qualitest NC9242720 (Fisher)
Lysol IC Andwin Científico NC9745686 (Fisher)
Vaccutainer BD # 8000813
Rato limitador Braintree Científica # TV-150
Irradiador JL Pastor e Associados Mark I 68A
Citómetro BD BD FACSCanto II
Tubo de ensaio de fluxo citómetro Falcão # 352052
Paquímetro digital Fisherbrand 14-648-17
Hemoccult TIC Beckman Coulter G0328QW

References

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  1. Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678(2012).
  2. Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameli....

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Bone Marrow TransplantationFlow CytometryColitis InductionDextran SulfateCD45 1 CD45 2 MarkersWild Type MiceKnockout MiceBone Marrow IsolationHistology AnalysisCell Staining

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