Nós desenvolvemos uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioactivos para o feto de rato. A via de entrega é mais eficiente na segmentação dos pulmões do rato fetal do que o normalmente usado injecção intra-amniótica. Este procedimento tem a data ainda não foi descrita em um modelo de rato.
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Artigo de método
Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Administração pulmonar de células pré-natal, genes ou agentes farmacológicos pode proporcionar a base para novas estratégias terapêuticas para uma variedade de doenças genéticas e adquiridas. Para além de anomalias congénitas ou herdada com o requisito de longo prazo da expressão do gene entregue, vários não-herdadas condições perinatais, onde a curto prazo a expressão do gene ou a intervenção farmacológica é suficiente para atingir os efeitos terapêuticos, são considerados como possíveis indicações futuras para esse tipo de abordagem. Doenças candidatos para a aplicação de curto prazo da terapia pré-natal poderia ser a deficiência transitória neonatal do B surfactante proteína causando 1,2 síndrome da angústia respiratória neonatal ou lesões hiperóxicas do pulmão neonatal 3. Doenças candidatos à correção terapêutica permanente são Fibrose Cística (FC) 4, variantes genéticas de deficiência de surfactante 5 e α1-antitripsina 6. <classe p = "jove_content"> Geralmente, uma vantagem importante da terapia genética pré-natal é a capacidade para iniciar a intervenção terapêutica no início do desenvolvimento, ou mesmo menos antes de manifestações clínicas no paciente, evitando assim danos irreparáveis no indivíduo. Além disso, os órgãos fetais têm uma taxa de proliferação aumentada das células, em comparação com órgãos adultos, o que pode permitir a um gene ou a transferência mais eficaz de células estaminais para o feto. Além disso, no útero de entrega de genes é realizada quando o sistema imunitário do indivíduo não está completamente madura. Assim, o transplante de células heterólogas ou suplementação de uma proteína não funcional ou ausente com uma versão correcta não deve causar sensibilização imunológica à célula, vector ou produto do transgene, que foi recentemente provado ser o caso com as terapias celulares e genéticas 7 .
No presente estudo, investigamos o potencial de alvejar diretamente da traquéia fetal em uma m ratoodelo. Este procedimento está em uso em animais de grande porte, como coelhos e ovelhas 8, e até mesmo em um ambiente clínico 9, mas tem a data ainda não foi realizado antes em um modelo de rato. Ao estudar o potencial da terapia gênica fetal para doenças genéticas, como a CF, o modelo de rato é muito útil como uma primeira prova-de-conceito por causa da grande disponibilidade de diferentes linhagens de camundongos transgênicos, a embriogênese bem documentado e desenvolvimento fetal, menos rigorosas normas éticas, gestação curto e tamanho da leitegada grande.
Vias de acesso têm sido descritos para atingir o pulmão fetal de roedores, incluindo a injeção intra-amniótica 10-12, (ultra-sonografia) intrapulmonar injeção 13,14 e administração intravenosa para os vasos do saco vitelino 15,16 ou veia umbilical 17. Nosso novo procedimento cirúrgico permite aos pesquisadores injetam o agente de escolha diretamente na traquéia do rato fetal que permitepara uma entrega mais eficaz para as vias aéreas do que as técnicas existentes 18.
Protocolo
1. Acasalamento dos Ratos obter Estágio gravidez desejada
Tempo de posicionamento ratinhos NMRI grávidas, de modo que eles são 18 dias (E18) grávidas (gestação total de E19.5), no momento da cirurgia. Antes e após a cirurgia, eles estão alojados em gaiolas de filtro superiores à temperatura ambiente normal e de luz normal, com livre acesso à água e ração.
2. Fetal Injecção (IT) intratraqueal (Figura 1)
- Primeiro submeter o rato NMRI grávida a anestesia geral com isoflurano a 1,5% numa mistura de O 2 a 1,5 L / min. O nível de isoflurano depende da idade e da cepa do rato, mas, em geral, o isoflurano devem estar a um nível que coloca os animais no estado anestésico. Em seguida, colocar o rato prenhe numa almofada de aquecimento (37 ° C) para manter a temperatura do corpo durante cirurgia.
- Todo o procedimento cirúrgico é realizado por dois cirurgiões. Um cirurgião vai realizar a dissecação do mouse grávida e posterior exposição dos thfeto e para a injecção intratraqueal. O segundo cirurgião irá executar a injecção intratraqueal fetal em si. O procedimento cirúrgico é realizado utilizando instrumentos estéreis e técnica asséptica.
- Desinfectar o abdômen com iodeto de povidona e executar uma laparotomia mediana para expor o útero grávido. Exteriorizar uma trompa uterina de cada vez e contar o número de sacos gestacionais. Um feto por buzina é operada e escolhido com base na posição óptima para a exteriorização da cabeça fetal nos passos subsequentes. O feto mais adequada é seleccionada por visualização através da parede uterina. O nariz da cabeça fetal deve apontar para o cirurgião que vai injetar na traquéia depois de expor a cabeça do feto e corrigi-lo para trás (como explicado no passo posterior 2,5).
- Primeiro passar por um de polipropileno 6-0 (Prolene) sutura em bolsa de cerca de 1 cm de diâmetro através da parede uterina e as membranas fetais (amniótico membrane e parietal saco vitelino) sobre a área onde, mais tarde, a cabeça do feto será exposto através. Isto mantém a sutura fixada no interior do feto a partir do útero ombros. Em seguida, faça uma incisão no útero dentro da cadeia bolsa de aproximadamente 0,8 cm, utilizando uma tesoura afiada.
- Espremer suavemente a cabeça e o pescoço do feto através da histerotomia. Puxe a sutura em bolsa gentilmente apertado ao redor do pescoço e fixe-o na posição com duas Micro-Mosquito fórceps. A cabeça fetal é mantido em hiperextensão por um 5-0 sutura poliglactina 910 (Vicryl) em duas pinças colocadas na boca em torno do maxilar superior.
- Sob microscopia estereoscópica zoom (ampliação x10) fetal a traqueia é visualizada através de uma incisão no pescoço vertical utilizando dissecção cortante e romba. A incisão na região do pescoço é de cerca de 5 mm de comprimento. É uma incisão superficial, tal como o tecido de base é ainda dissecada através de dissecção romba para atingir a traqueia.
- Sob visão directa através de um microscópio estereoscópico zoom, injectar um volume total de 30 ul de substância (por exemplo, contas fluorescentes ou o vector viral) na traqueia usando uma seringa de vidro de 50 uL de Hamilton com uma agulha de 30 G afiada. Após a remoção da agulha, o efluxo de um mínimo de líquido injectado assegura uma injecção correcta. A incisão não é fechado após a injecção.
- Para substituir a cabeça no útero, aplique uma leve pressão sobre o nariz. O pescoço primeira volta para o útero, seguido pela cabeça. O nariz vai em último. Em seguida, fechar a histerotomia apertando a corda bolsa. Depois injectar um total de cerca de 0,5 ml de solução fisiológica na cavidade amniótica para evitar oligoidrâmnio. Para fazer isso, insira uma agulha na incisão dentro da cadeia de bolsa. Em seguida, fechar a sutura em torno da agulha, após a qual a solução salina é injectado. Num último passo, retrair a agulha, seguido pelo fechando completamente a pUrse string.
- Fechar a parede abdominal materna (peritoneu e a camada muscular interna e externa) e de pele com uma sutura de Vicryl 5-0 executado em duas camadas separadas. A partir daí, infiltrar a incisão com xilocaína de 0,2% para o pós-operatório o alívio da dor. Recomenda-se a utilização de buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg SC ou IP) para o pós-operatório alívio da dor. Nem tocolíticos profiláticas nem antibióticos são usados. Os ratinhos são mantidos numa almofada de aquecimento (37 ° C) até que eles são totalmente recuperado (aproximadamente 1 hr).
3. Fetal intra-amniótica de injeção (IA)
- Ver 2.1
- Desinfectar o abdômen com iodeto de povidona e executar uma laparotomia mediana para expor o útero grávido. Exteriorizar uma trompa uterina de cada vez e contar o número de sacos gestacionais.
- Injecção IA pode ser realizada em todos os fetos que leva menos tempo para executar. Além disso, a posição do feto não é crítical em comparação com a injecção intratraqueal. À medida que a parede do útero é semi-transparente, as estruturas fetais, tais como a cabeça, membros e da posição da cauda e placentária são bem visíveis.
- Usando a mesma agulha e seringa como acima (2.7), injecta-se 30 ul de substância na vizinhança da boca do feto. Isto pode ser feito mais facilmente, entre a cabeça fetal e membros anteriores, ou entre os membros inferiores e da cauda. A injecção é feita apenas depois de um exame cuidadoso da posição da agulha para assegurar que nenhuma das estruturas fetais estão em contacto com a ponta no momento da injecção.
- O útero é reposicionado no abdômen e na parede abdominal e pele fechada como descrito acima (2,9).
4. Avaliação de fetos injetado e Cross-promoção
- Mate a barragem usando um método aprovado eutanásia 36 horas após a intervenção fetal (em E19.5). Deslocamento cervical, sem adicionalanestesia seria o melhor método, como todas as outras formas de eutanásia, que incluem anestesia (por exemplo, isoflurano, pentobarbital) vai anestesiar ou até mesmo matar os fetos, o que você gostaria de evitar em todos os momentos. Entregar os fetos-operado sobre por cesariana. Os fetos operados são identificados no útero através da sua posição. Bolsas amnióticas são numerados a partir do final de ovário do útero bicorno.
- Após o parto, os critérios que se seguem são utilizadas para avaliar a viabilidade dos fetos: a presença de (1) um batimento cardíaco, (2) a cor-de-rosa da pele (face cianótica) e (3) movimentos espontâneos. Coloque os filhotes apenas que satisfazem estes critérios na maca uma mãe adotiva, contendo um dia filhotes antigos. Por experiência, sabemos que os filhotes com um batimento cardíaco fraco, cor de pele cianótica e / ou mínimos movimentos espontâneos muitas vezes não vai sobreviver devido à rejeição da ninhada a mãe adotiva ou por canibalismo materno.
- Após a entrega ofa corante visível através da injecção de TI ou IA (por exemplo, moléculas fluorescentes vermelhas), é possível assegurar uma injecção correcta pela presença deste corante (cor-de-rosa das fluospheres injectados vermelho) na torácica (por injecção directa para os pulmões após a IT , por injecção ou por inalação para dentro dos pulmões após a injecção IA) ou a cavidade abdominal (ingestão). Isto é possível devido ao facto de ratos recém-nascidos são semi-transparente permitindo a avaliação in vivo dos pulmões e estômago.
- Marque os filhotes corretamente injetados com tinta chinesa por via subcutânea acima da base da cauda. Coloque todos os filhotes, que preencham os requisitos mencionados em 4.2 na maca a mãe adotiva.
- Para garantir a aceitação máxima e sobrevivência dos filhotes operado-on, não deixam mais de 10 filhotes no total na maca a mãe adotiva (ambos próprios seus filhotes um dia de idade, assim como os filhotes cross-promovidos). Antes de colocar o filhote operado-ons na maca a mãe adotiva, cobri-los em material de cama da mãe adotiva, que contém ambos os seus fezes e urina para mascarar odores não-familiares.
- Coloque a gaiola em um ambiente silencioso e não perturbe a cama por pelo menos 12 horas (durante a noite).
- No dia seguinte, avaliar cuidadosamente a taxa de sobrevivência de promover contando todos os filhotes, fazendo a distinção entre os filhotes da mãe adotiva dos filhotes e operado-ON (marcado com tinta chinesa e, em média, menor do que os outros filhotes). Minimizar o tempo de manipulação desses filhotes para evitar a rejeição pela mãe e para evitar a hipotermia. Em geral, se os filhotes não têm qualquer leite no estômago (que é visível, devido à natureza semi-transparente de crias recém-nascidas), o prognóstico é muito pobre para a sobrevivência mais destes animais.
5. Resultados representativos
O esquema geral do experimento é descrito em Figur2 e.
Determinação do volume ideal para a injecção intratraqueal
Para determinar o volume ideal para a TI de injecção, nós escolhemos empiricamente diferentes volumes que variam de 10, 20 a 30 uL (n = 3/volume). Para a detecção fácil, nós escolhemos para injetar moléculas fluorescentes vermelhas (fluospheres, sondas moleculares, Leiden, Holanda) EMPRESAS 100 nm. Após a injecção de TI em fetos E18 velhos, os pulmões foram colhidos 24 horas mais tarde, fixadas em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C e 6 uM secções congeladas foram feitas. Filamentos de actina e núcleos foram corados com Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) e Alexa Fluor 488 faloidina (Invitrogen, Merelbeke, Belgium), respectivamente, durante 20 min à temperatura ambiente. Imagens confocal foram feitas usando um Biorad Radiance 2100 microscópio confocal com LaserSharp2000.6 software pela Carl Zeiss. A fluorescência relativa (razão de fluorescência vermelha para azul fluospheres representando e stainin nuclearg, respectivamente) foi quantificada utilizando o software ImageJ em linha (Figura 3). Embora no momento da cirurgia fetal, um refluxo foi detectada apenas após injecção de 30 ul, indicando um excesso de fluídos injectados, 30 ul deu a quantidade mais elevada de sinal fluorescente no parênquima do pulmão, tal como quantificada através da medição da fluorescência relativa (análise de variância , as comparações para cada par utilizando teste t de Student, * p <0,05, *** p <0,001).
Avaliação quantitativa de fluospheres no tecido pulmonar e biodistribuição para o trato gastro-intestinal
Em seguida, quis comparar a eficiência da segmentação do pulmão do rato fetal após TI contra injeção IA. Para isso, 30 ul de fluospheres foram entregues para o pulmão do rato fetal após uma TI ou injeção IA em E18 ratas grávidas NMRI (n = 5 por grupo). IT injecção resultou numa distribuição significativamente mais elevada de fluospheres ao pulmão fetal em comparação com o IA. rota (1,43 ± 0,56 e 0,05 ± 0,02 fluorescência relativa (razão de fluospheres a Hoechst, respectivamente, da análise de variância, teste t de Student, *** p <0,001) (Figuras 4 ac). fetos de controlo não tratadas foram utilizadas para a normalização da fluorescente sinal de fundo. O trato gastro-intestinal foi positivo para ambos os TI e os animais injectados IA (Figura 4 d). Nenhuma fluorescência vermelha foi observada em outros tecidos de fetos tratados ou nos animais de controlo negativo (dados não mostrados).
Comparação da injecção intratraqueal e intra-amniótica após a entrega do gene mediada rAAV2/6.2 no pulmão fetal
Depois de comparar os dois métodos de entrega pela injeção de moléculas fluorescentes, queríamos avaliar a eficiência de transdução viral e expressão gênica subseqüente TI e injeção IA usando vetores rAAV. rAAV2/6.2 codificação firefly luciferase (FLUC) (3x10 10 GC feto /)sob o controlo do frango β-actina promotor (CBA) foi injectado IT (n = 8) ou IA (n = 6) em fetos de ratos NMRI em E18. Depois de cesariana e fomento, sobrevivendo filhotes foram acompanhados por não-invasivo de imagem de bioluminescência (BLI) e monitorados para a atividade FLUC (fótons / segundo, p / s) em uma semana de idade (Figura 5). O fluxo de fótons total para o grupo de TI foi significativamente maior do que no grupo IA e o controlo negativo (análise de variância, comparações para cada par utilizando teste t de Student, * p <0,05). O sinal de BLI média no grupo IA, não foi significativamente mais elevado do que no grupo de controlo negativo.
Distinção entre uma correta e uma injeção fetal incorreta intratraqueal
Distinção entre um correcto e um incorrectI.T. injeção pode ser avaliada em vários níveis. No ponto de tempo de operação, durante a injecção para dentro da traqueia fetal, nenhuma resistência será notado, quando a needle é posicionado na traqueia. No entanto, uma maior resistência será notado quando se injecta no espaço paratraqueal. Em segundo lugar, a cesariana para o feto é semi-transparente, pode-se ver os pulmões e, subsequentemente, a presença de um corante visível (por exemplo, tinta da China, moléculas fluorescentes). A última opção para avaliar uma injeção correto é por imagens ópticas e mais especificamente imagem de bioluminescência. BLI é um sistema elegante de forma não invasiva a expressão do gene de seguimento do gene repórter da luciferase de pirilampo, mas a resolução espacial e informação anatómica são limitados. A ressonância magnética (RM) fornece alta resolução, imagens tomográficas contendo informações anatômicas detalhada. Portanto, investigou a combinação de BLI com a ressonância magnética para obter uma imagem sobreposta, que combina a superfície com um sinal de BLI visualização das estruturas anatômicas profundas (órgãos internos). O nosso objectivo era obter informação mais detalhada em in vivo do local,ização da expressão do gene para ser capaz de distinguir um correto de uma injeção de errado.
Combinados BL-MR imagens foram adquiridas em vários animais injectados com TI rAAV2/6.2 CBA-Fluc e CBA-LacZnls (3x10 10 GC feto / para cada vector, n = 10) com uma semana de idade (Figura 6). BL revelou um sinal de imagem que emana do pescoço e na região torácica. Co-registo de MRI com BLI expressão do gene da luciferase localizado na região pulmonar na sequência de uma injecção correcta (Figura 6 a), mas, no pescoço e área abdominal após uma injecção incorrecta (Figura 6 b). A análise histológica por X-gal coloração confirmou a in vivo co-registro.
Sobrevivência após a injeção intratraqueal e intra-amniótica
- Fluoroesferas
A sobrevivência até a entrega do E18 fetos velhos NMRI injetado TI ou IA com 30 ul 100 nm vermelho fluorescenmoléculas t foi de 100% em ambos os grupos e foi definido como o número de fetos vivos injectados no momento da colheita, 24 horas após o procedimento cirúrgico fetal (Tabela 1). - rAAV vetor
A sobrevivência a entrega de fetos injectado TI ou IA com rAAV2/6.2, que é definido como o número de fetos vivos no ponto de tempo após a injecção de cesariana secção 36h fetal, foi de 85,3% e 86,3%, respectivamente (Tabela 1). A taxa de sobrevivência neonatal precoce foi de 53,3% (TI) e 74,5% (IA), respectivamente, e foi calculado através da correlação do número de filhotes vivos 1 dia após a promoção com o número inicial de fetos infectados. Para obter estas taxas de sobrevivência finais, optimizada do protocolo de procedimento cirúrgico peri-operatório usando-se (1) por inalação de isoflurano como anestesia em vez da administração de uma mistura de cetamina (75 mg / kg ip) e medetomidina (1 mg / kg ip) , (2) uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia durante a cirurgia, (3),um microscópio estereoscópico e zoom (4) os operadores ficando mais experiente, com o procedimento cirúrgico.
Figura 1. Injeção intratraqueal em E18 fetos de ratos. Nesta figura, as principais etapas do procedimento cirúrgico para a injeção de TI fetal são descritos. No primeiro passo, um corno uterino é exteriorizado. Em uma próxima etapa, uma sutura de fio de bolsa é passada através da parede do útero e das membranas fetais (membrana amniótica e parietal saco vitelino) sobre a área onde, mais tarde, a cabeça do feto será exposto através. Em seguida, a cabeça e o pescoço do feto são exteriorizados através da histerotomia, após o que a cabeça do feto é mantido em hiperextensão por um 5-0 poliglactina 910 de sutura em duas pinças entre as mandíbulas. Na microscopia estereoscópica zoom (ampliação x10) a traquéia fetal é visualizado por fazer um incis pescoço verticaisiões utilizando dissecção aguda e sem corte. Num último passo, um volume total de 30 ul de substância é injectada para dentro da traqueia sob visão directa através de um microscópio estereoscópico zoom.
A Figura 2. Visão geral da experiência.
Figura 3. Determinação do volume ideal para a injecção intratraqueal. Para determinar o volume ideal para a injecção IT, 10, 20 ou 30 ul (n = 3/volume) de fluospheres vermelhos avaliou 100 nm foram administrados em fetos E18 velhos e os pulmões foram colhidos 24 hr mais tarde. Filamentos de actina e núcleos foram corados com Hoechst 33258 e Fluor Alexa 488 faloidina respectivamente. A fluorescência relativa (razão de vermelho para azul fluorescente representa fluospheres e coloração nuclear, respectivamente) foi quantificada usando ImageJ software online. Média ± DP, análise de variância, comparações para cada par utilizando teste t de Student, * p <0,05, *** p <0,001.
Figura 4. Avaliação quantitativa de fluospheres no tecido pulmonar e biodistribuição para o trato gastro-intestinal. 30 ul de fluospheres vermelhos foram entregues no pulmão do rato fetal após (a) IT ou (b) a injecção IA em E18 ratinhos NMRI grávidas para comparar a eficiência da segmentação do pulmão de rato fetal. Fetos de controlo não tratadas foram utilizadas para a normalização do sinal de fundo fluorescente. Filamentos de actina e núcleos foram corados com Hoechst 33258 e Alexa Fluor 488 faloidina, respectivamente. (C) A fluorescência relativa (razão de vermelho para azul fluorescente representa fluospheres e coloração nuclear, respectivamente) foi quantificada utilizando o software ImageJ online. (d) O trato gastro-intestinal foi positivo para ambos os TI e os animais injectados IA. Média ± DP, análise de variância, teste t de Student, *** p <0,001. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 5. Comparação da injecção intratraqueal e intra-amniótica após a entrega do gene mediada rAAV2/6.2 no pulmão fetal. BLI sinal de 1 semana após a injecção de rAAV2/6.2 (3 x 10 10 GC feto / CBA-Fluc) com quantificação de fluxo de fótons correspondente totais . Todos os animais foram verificados, separados por divisórias pretas, a fim de evitar a dispersão dos fotões para animais vizinhas. A escala pseudo descreve o fluxo de fótons por segundo, Por centímetro quadrado por esterradiano (p / s / cm 2 / sr). As medidas foram obtidas na região de 4,3 cm 2 rectangular de interesse. Média ± DP, análise de variância, comparações para cada par utilizando teste t de Student, * p <0,05. Figura adaptado de Carlon et al., 2010. Reproduzido com permissão de Macmillan Publishers Ltd: [Molecular Therapy] (doi: 10.1038/mt.2010.153), direitos de autor (2010). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 6. Distinção entre uma correta e uma injeção fetal incorreta intratraqueal seguindo rAAV2/6.2 entrega do gene mediada no pulmão fetal. Combinado BL-MR imagens foram adquiridas em vários animais injetados TI com rAAV2/6.2 CBA-FLUC e CBA-LacZnls (3x10 10 GC / feto para cada vector) com uma semana de idade. BL revelou um sinal de imagem que emana do pescoço e na região torácica. Co-registo de MRI com BLI expressão do gene da luciferase localizado na região pulmonar na sequência de uma injecção correcta (a), mas, no pescoço e área abdominal após uma injecção incorrecta (b). Análise histológica confirmou o in vivo co-registro. Barra de escala = 100 pm. Figura adaptada de Carlon et al., 2010. Clique aqui para ver maior figura .
| Substância injeção | Método de injeção | Sobrevivência para uma entrega | A taxa de sobrevivência de fomentar b | Neonatal precoce taxa de sobrevivência c |
| fluospheres | TI | 100 (8/8) | nd | nd |
| IA | 100 (5/5) | nd | nd | |
| rAAV2/6.2 | TI | 85,3 (64/75) | 62,5 | 53,3 (40/75) |
| IA | 86,3 (44/51) | 86,4 | 74,5 (38/51) |
Tabela 1. Sobrevivência após a injeção intratraqueal e intra-amniótica do feto. Uma Sobrevivência para entrega ou seja, após a cirurgia fetal e na cesariana, antes de fomento. Pups b só foram promoveu se fossem rosa, movendo-se e respirando normalmente. C A taxa de sobrevida neonatal precoce é expressa como uma função do número inicial de filhotes injectados. Abreviaturas: TI injeção intratraqueal; injeção intra-amniótica IA; na não aplicável.
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Discussão
Etapas críticas
- A cepa do mouse optamos por trabalhar com camundongos NMRI é porque eles têm um abundante número de filhotes (tamanho da ninhada média de 14,4 ± 1,8, dados próprios), tolerar intervenções bem e têm boas características maternas.
- Colocar o fio de bolsa através da parede uterina e as membranas fetais é um passo crítico como você só quer expor a cabeça do feto e não os ombros, caso contrário, o reposicionamento é quase impossível sem causar trauma.
- Uma ótima posição da cabeça f...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
MC e AVDP são bolsistas de doutorado suportados por verbas do Instituto para a Promoção da Inovação através da Ciência e da Tecnologia na Flandres (IWT-Vlaanderen). JT mantém um part-time Bolsa de Investigação Clínica (Koor) da UZ Leuven. DV é um doutorado apoiado por uma subvenção da KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC é um doutorado apoiado por uma concessão do Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) e Erasmus Mundus. A pesquisa foi financiada pela navegação fluvial-Vlaanderen, pela concessão CE DIMI (LSHB-CT-2005-512146) e pelo In vivo Molecular Imaging Research grupo (IMIR) da KU Leuven. Gostaríamos de agradecer o Núcleo Vector UPenn fundada por James M. Wilson para seu presente tipo da embalagem AAV6.2 plasmídeo para rAAV produção vetor.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | Comentários (opcional) |
| Camundongos NMRI | Janvier, Le Genest St Isle, França | ||
| Isoflurano | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, Reino Unido | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Bélgica | ||
| 50 pL de Hamilton seringa de vidro, Modelo 1710,5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, EUA | 5495-20 | |
| Agulha de 30G afiada | Hamilton, Reno, NV, EUA | 7762-03 | |
| Xilocaína 2% | AstraZeneca, Zoetermeer, na Holanda |
Referências
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
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