Apresenta-se um método para recolher fluido cerebrospinal (CSF) e para criar um sistema que não tem CSF dentro do sistema ventricular embrionário do peixe-zebra cérebro. Isto permite uma análise mais aprofundada de CSF composição e sua exigência durante o desenvolvimento do cérebro embrionário.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Drenagem Manual dos Zebrafish ventrículos cerebrais embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Líquido cefalorraquidiano (LCR) é um fluido rico em proteínas contidas dentro dos ventrículos do cérebro. Encontra-se presente durante o desenvolvimento embrionário precoce dos vertebrados e persiste durante toda a vida. Adulto CSF é pensado para amortecer o cérebro, remover resíduos, e proceder secretado 1,2 moléculas. No embrião de adultos e mais velhos, a maioria dos CSF é feita pelo plexo coróide, uma série de regiões altamente vascularizadas secretoras colocadas junto dos ventrículos do cérebro 3-5. No peixe-zebra, o plexo coróide está completamente formado a 144 horas pós-fertilização (hpf) 6. Antes disso, em embriões de vertebrados tanto peixe-zebra e outros, incluindo ratinho, uma quantidade significativa de embrionário CSF (eCSF) está presente. Estes dados e os estudos em pintainho sugerem que o neuroepitélio é secretória precoce no desenvolvimento e pode ser a fonte principal de eCSF antes do desenvolvimento do plexo coróide 7.
eCSF contém cerca de três vezes mais proteína than adulto CSF, sugerindo que pode desempenhar um papel importante durante o desenvolvimento 8,9. Os estudos realizados em pintos e de rato demonstram que os factores secretados no eCSF, a pressão do fluido, ou uma combinação destes, são importantes para a expressão do gene neurogenesis sobrevivência, a proliferação de células, e células, no neuroepitélio 10-20. Análises proteômicas de rato, humano, mouse e eCSF garota identificaram muitas proteínas que possam ser necessárias para a função LCR. Estes incluem componentes da matriz extracelular, apolipoproteínas, proteínas que regulam a pressão osmótica, e proteínas envolvidas na morte celular e proliferação 21-24. No entanto, as funções complexas do eCSF são largamente desconhecidos.
Desenvolvemos um método para a remoção de eCSF ventrículos cerebrais zebrafish, permitindo assim a identificação de componentes eCSF e para a análise do requisito eCSF durante o desenvolvimento. Embora mais eCSF podem ser coletadas de outros vertebrados sistemas wom embriões maiores, eCSF podem ser coletadas desde os primeiros estágios de desenvolvimento do peixe-zebra, e sob condições genéticas ou ambientais que levam ao volume anormal do cérebro ventrículo ou morfologia. Remoção e recolha de eCSF permite a análise de espectrometria de massa de inquérito, de função eCSF, e reintrodução de factores seleccionados para os ventrículos para ensaiar a sua função. Assim, a acessibilidade do embrião do peixe-zebra precoce permite a análise detalhada da função eCSF durante o desenvolvimento.
Protocolo
1. Preparando agulhas microinjeção e Bonde celular
- Encha Eppendorf CellTram óleo aparelho microinjector com óleo mineral de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare agulhas microinjeção puxando tubos capilares utilizando Sutter extrator agulha instrumentos.
- Montar a agulha na micromanipulador Eppendorf CellTram conectado.
- Parta cuidadosamente a ponta da agulha. Para tamanho da ponta uniforme, medir com um micrômetro, ou comparar a uma agulha de referência.
- Encher o comprimento da agulha com óleo, usando o CellTram para empurrar para baixo o comprimento de petróleo, tendo o cuidado para evitar as bolhas. <....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um exemplo de um ventrículo cerebral drenado é mostrado na Figura 1B, C-. Ventrículos cerebrais são recolhidos como falta eCSF (Figura 1B vs C). Como se vê nas imagens dorsal (Figura 1B-C, e A Figura 2A-D) do neuroepitélio rombencéfalo retém a sua morfologia característica e parece ser aberta, apesar da falta de eCSF provavelmente devido à robustas dobradiças-pontos. No entanto, vistas laterais (Figura 2A'-D ") demonstram que o.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
A utilização desta técnica para drenar manualmente eCSF de ventrículos cerebrais zebrafish será útil para a determinação da exigência de eCSF durante o desenvolvimento. Além disso, esta técnica permite a descrição do perfil proteico eCSF ao longo do desenvolvimento embrionário. Identificação de proteínas diferentes durante este tempo irá permitir uma investigação mais aprofundada sobre a função do LCR e o seu papel potencial durante o desenvolvimento do cérebro. No amniotas, alguns factores identificados no eCSF (IGF2, .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional para a Saúde Mental, e da National Science Foundation. Um agradecimento especial ao Dr. Jen Gutzman, Amanda Dr. Dickinson e outros membros do laboratório SIVE para muitas discussões úteis e críticas construtivas, e Olivier Paugois para criação de peixes especialista.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Eppendorf CellTram óleo | Eppendorf | 516 000.025 | |
| Óleo mineral | Sigma | M8410 | |
| Tricaina pó | Sigma | A5040 | |
| Tubos capilares | FHC Inc. | 30-30-1 |
Referências
- Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).
- Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebros....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
