Um ensaio de explante para avaliar o comportamento celular do mesênquima craniana

Resumo

O mesênquima craniana sofre movimentos morfogênicos dramáticas que provavelmente fornece uma força motriz para a elevação das pregas neurais ^1,2. Aqui nós descrevemos um simples Ex vivo Explantar ensaio para caracterizar os comportamentos celulares do mesênquima craniana durante neurulação. Este ensaio tem inúmeras aplicações, sendo inclusive passível de manipulações farmacológicas e análises de imagens ao vivo.

Resumo

O sistema nervoso central é derivado da placa neural que sofre uma série de movimentos morfogenéticos complexos resultantes da formação do tubo neural em um processo conhecido como neurulação. Durante a neurulação, a morfogênese do mesênquima que está na base da placa neural é acreditado para conduzir elevação vezes neural. O mesênquima craniana é composta da mesoderme paraxial e células da crista neural. As células do mesênquima cranial forma uma malha composta por pourous estreladas células em forma e mistura da matriz extracelular (ECM) que suportam os fios dobras neurais. Durante a neurulação, o mesênquima craniana sofre rearranjos estereotipadas, resultando em sua expansão e esses movimentos são acreditados para fornecer uma força motriz para a elevação vezes neural. No entanto, os caminhos e comportamentos celulares que levam morfogênese mesênquima craniana permanecem pouco estudados. As interacções entre a ECM e as células do mesênquima os cranianos thes underlycélulas de comportamentos e. Descrevemos aqui um simples ensaio ex vivo do explante concebido para caracterizar o comportamento dessas células. Este ensaio pode ser alterada para manipulações farmacológicas para dissecar a vias de sinalização envolvidos e as análises de imagem em tempo real para caracterizar ainda mais o comportamento dessas células. Apresenta-se um experimento representativo que demonstra a utilidade deste ensaio para caracterizar as propriedades migratórias do mesênquima cranial em uma variedade de componentes da matriz extracelular.

Introdução

Fechamento do tubo neural na região craniana ocorre entre os dias embrionário 8,5 (E8.5) e 9,5 no embrião de rato. Deixar de fechar o tubo neural nos resultados de cabeça em anencefalia, um defeito de nascença estrutural comum em humanos e é incompatível com a vida. As forças que impulsionam fecho do tubo neural cefálica são gerados a partir de amostras de tecido neural e da epiderme circundante e mesênquima ^3. Em particular, a expansão do mesênquima craniana é pensado para ser essencial para a elevação de ^1,2 dobras cranial neural. O mesênquima craniana é rica em proteínas de ECM em particular proteínas glicosiladas como proteoglicanos de sulfato de heparina, sulfatos de condroitina e hialuronato de ^4-8.

Ao contrário do embrião de galinha, onde as células da crista neural emigrar do tubo neural após o fecho dorsal do tubo neural, da crista neural no embrião de rato migra ao mesmo tempo que as dobras neurais começam a rise (depois da fase de somito 5). Assim, durante neurulação no embrião de ratinho, o mesênquima crânio é composto de células derivadas da crista neural e da mesoderme paraxial. Crista neural e populações mesoderma paraxial são induzidas em diferentes momentos do desenvolvimento; localizadas em diferentes posições no embrião e se desenvolvem em diferentes estruturas ^9,10. A mesoderme paraxial origina da linha primitiva e migra para a região anterior do embrião para a base da placa neural presuntivo. A crista neural é induzida na junção da placa neural e ectoderme epidérmica, sofre uma transição epitelial para mesênquima e delamina imediatamente antes da elevação dobra neural do embrião de roedor. Células da crista neural migram ao longo de caminhos estereotipados no mesoderma paraxial subectodermal ao arco branquial, frontonasal e mesênquima periocular. A mesoderme paraxial contribuirá para alguns dos ossos da calota crânio e músculos do rosto, enquanto ªe crista neural contribuirá para outros ossos do crânio e face, além de nervos cranianos ^9-11. A mesoderme paraxial e linhagens da crista neural podem ser diferencialmente marcada pela Mesp1-CRE-CRE e Wnt1 linhas de camundongos transgênicos, respectivamente ^9.

O papel essencial do mesênquima cranial em fechamento do tubo neural foi inferida a partir de experiências em que o tratamento de embriões de roedores com ECM perturbar agentes tais como hialuronidase, condroitinase ABC, heparitinase ou Diazo-oxo-norleucina (DON) durante neurulação fecho do tubo neural prejudicada ^{7, 12-14.} Nestas experiências, a análise histológica de secções de sequência estáticos neurulação revelou dysmorphogeneis associados do mesênquima cranial ^7,12-14. No entanto, uma vez que o agente teratogénico tiveram acesso a vários tecidos, que continua a ser determinado se o mesênquima craniana é realmente o tecido alvo. Em apoio à conclusão de que este tecidoé essencial para a neurulação, o mesênquima craniana anormal aparece nas análises histológicas em alguns mutantes do mouse com exencefalia ^15-17. Mesmo assim, na maioria dos casos, o efeito da mutação sobre o comportamento celular do mesênquima cranial não foi tratada.

Concebemos um ensaio ex vivo do explante para examinar directamente a consequência de uma mutação genética ou manipulação farmacológica sobre o comportamento das células mesenquimais cranianos ^15. Este ensaio é semelhante ao publicado por Tzahor et al 2003 para aceder ao potencial de diferenciação do mesênquima subjacente cranial as ¹⁸ rhombomeres excepto que modificaram o dissecção explante para estudar as propriedades migratórias de populações mais anterior do mesênquima que estão na base do crânio neural anterior placa. O nosso método é também uma modificação dos ensaios de explante realizado no embrião de galinha para analisar o comportamento migratório da crista neural com kediferenças y. Preparações anteriores explantado da crista neural ou o mesoderma paraxial mais posterior ^19,20. Além disso, durante a elevação dobra neural do embrião de galinha, a crista neural ainda não migraram a partir do tubo neural dorsal e, assim, explantes tomadas da mesoderme paraxial anterior não contêm células da crista neural. No nosso ensaio, explantes mesênquima cranianos consistindo de mesoderma paraxial, crista neural e ectoderme superfície são preparadas e semeadas sobre um substrato. Manipulação experimental, incluindo isolamento a partir de explantes de mutantes genéticos, plaqueamento de explantes em ECM diferente ou tratamentos farmacológicos pode ser realizada. As células migram a partir do explante e da distância, o número e o comportamento pode ser analisado e comparado entre os grupos de tratamento. Além disso, esta preparação pode ser alterada para análises de migração celular por meio de técnicas de imagiologia vivos. Após a experiência da migração, os explantes podem ser fixados e submetidos a imunohistoquímica para pelesTher elucidar o efeito dos tratamentos. De um modo geral, o protocolo aqui apresentado é um ensaio in vivo simples ex para investigar o comportamento do mesênquima cranial. Como um experimento representativo, utiliza-se este ensaio para analisar a migração do mesênquima cranial em diferentes substratos extracelulares.

Protocolo

1. Preparação de Pratos Cultura ECM revestidos ou Lamelas

1. Preparar solução de ECM por dissolução ECM substrato em PBS (Dulbecco tamponada com fosfato, Invitrogen, # 14040-133). Filtrar através de um filtro de seringa de 0,2 milímetros (VWR, # 28145-495) e congelar em alíquotas a -80 ° C.
2. Diluir ECM solução estoque em PBS a uma concentração desejada. Para MaxGel, dilua em meio DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium, Invitrogen, # 11995-065).
3. Se imunofluorescência será executada, esterilizar 12 milímetros lamelas de vidro circulares (VWR, # 89015-724), por imersão em etanol e deixar secar ao ar. Isto deve ser feito na capa laminar estéril. Se imunofluorescência não será realizada pule para o passo 1.5.
4. Lugar esterilizada lamelas em cada poço de uma placa de 24 poços (Corning, # 3526).
5. Adicionar 0,5 ml de solução de substrato diluído a cada poço da placa de 24 poços e incubar à temperatura ambiente durante 3 hr.
6. Aspirar a solução de ECM e lavar threE em tempos de PBS.
7. Aspirar PBS e utilizar imediatamente, ou enrolado em parafilme e armazenadas a 4 ° C durante até 2 semanas.

2. Preparação de instrumentos de dissecação

Placas Sylgard com carvão adicionado são preparadas por protocolo do fabricante. O fundo preto resistente destas placas fornece suporte para a fixação do embrião para baixo e a cor oferece um bom contraste que facilita a visualização do embrião translúcido.

1. Para preparar pratos pesam diretamente em um copo tri-derramar sobre um equilíbrio Parte 150 g Um líquido 15 g Parte B e 1 pó de carvão g (Instrumentos de Precisão Mundo, # SYLG184). Misture usando um palito de picolé de madeira ou espátula. Despeje em vidro ou plástico de 100 pratos centímetros. Usar um maçarico de butano pequena realizou cerca de 10 a 12 polegadas acima dos pratos para queimar as bolhas. Tampas lugar em placas e deixe descansar por pelo menos 24 horas para definir.
2. Para preparar instrumentos de dissecação inserção de um pino Minutien (0,1 milímetros diameter) para um suporte de pino (Belas ferramentas científicas, # e # 26002-10 26018-17, respectivamente), em alternativa, agulhas de calibre 26 (BD, # 309597) dobradas em ângulo recto com o auxílio de uma pinça podem ser utilizados como instrumentos de dissecação. Afiadas Estudante Dumont # 5 Fórceps (Ferramentas Ciência Fine, # 91150-20) usando uma pedra de amolar (Belas ferramentas científicas, # 29008-22).
3. Esterilizar todas as ferramentas de dissecação com etanol 70% antes da utilização.

3. Coleta de embriões

1. Euthanize o mouse cronometrado grávida de 8,5 post coitum dias de acordo com os regulamentos da comissão de animais de uso e remover útero.
2. Útero lugar em uma placa de Petri de plástico com PBS estéril.
3. Lavar uma vez com PBS útero estéril.
4. Sob um microscópio de dissecção remova cuidadosamente embrião do deciduas usando um par de fórceps.
5. Remover Membranas Extra-Embrionárias e salvar para a genotipagem, se necessário.
6. Fase embrionária através da contagem somitos. Os estágios ideais para fazer explantes para analisar celular behAvior durante a elevação vezes neural seria entre os 6 e os 10 estágios somito quando as pregas neurais estão apenas começando a elevar e antes da morfogênese principal do mesênquima craniano ocorre.
7. Lavar embrião em PBS. Coloca-se num prato de Sylgard preto com DMEM que contém nenhuma vermelho de fenol (Invitrogen, # 21063-029). Remova as membranas extraembryonic e salvar para a genotipagem, se necessário.

4. Preparação de Explantes

1. Recentrar o microscópio com a ampliação mais elevada possível ao longo da região da cabeça do embrião.
2. Faça cortes com uma agulha de dissecção em cada mão. Use uma agulha para manter o tecido no seu lugar e o outro para fazer cortes.
3. Cortar a cabeça do embrião anterior aos rhombomeres.
4. Corte ao longo da linha média para bifurcar a cabeça em duas metades iguais.
5. Corte em torno das franjas exteriores da cabeça e linha média. Estes cortes vão remover a crista premigratory e ectoderme superfície na fronteira externa ea placa precordial na linha média. O tecido remanescente será o explante e irá conter a migração de crista neural cranial, mesoderme e ectoderme superfície paraxial.
6. À medida que o tecido é cortado, remover detritos dissecado do prato usando uma pipeta de pasteur estéril. Isto impede confundir o explante com os restos dissecados.
7. Delicadamente, lave o explante pipetando cima e para baixo com uma pipeta de 20 ul ponta e Pipetman. Isto irá remover células frouxamente ligados e evitar bordas irregulares em explantes.
8. Cuidadosamente pegar cada explante em cerca de 10 uL de líquido utilizando uma pipeta de 20 uL e ponta Pipetman e lugar no centro da cultura revestida.
9. Adicionar 20 ul de meio de cultura suplementado com 15% de FBS para cobrir o explante.
10. Colocar a placa numa incubadora de cultura de tecidos humidificada (5% de CO _2, 37 ° C) durante 1-2 horas para permitir que o explante para prender a parte inferior do prato. Ver periodicamente para garantir que o explante não secapara fora.
11. Quando o explante tem anexado, cuidadosamente adicionar a cada cavidade 250 ul de DMEM suplementado com FBS a 10% que foi aquecida a 37 ° C em banho-maria. Uma vez explantes foram ligados eles não se movem quando o prato é suavemente agitada sob microscópio.
12. Retornar ao prato de cultura de tecidos incubadora.
13. Após 24 h, os explantes serão solidamente presas e células vão começar a emigrar. Neste momento agentes farmacológicos podem ser adicionados aos meios de comunicação.
14. 48 h após o plaqueamento, as células migraram a partir dos explantes. A distância migrada pode ser visualizada e impressa. Nós normalmente parar a cultura neste ponto desde explantes começam a mostrar sinais de viabilidade diminuiu com incubações mais longos. Um corante vital tal como laranja de acridina ou azul tripano pode também ser usado para verificar a viabilidade do explante.
15. Neste ponto, as imagens podem ser adquiridas para documentar a distância e o número de células que migram a partir do explante. Alternativamente, se explantes foram semeadas em lamelas,eles podem ser corrigidos e as análises de imuno-histoquímica realizada para visualizar as proteínas de interesse.

Etapas críticas no protocolo

1. Cortar os explantes de aproximadamente o mesmo tamanho.
2. Limpar todos os detritos dissecção fora do prato dissecar como você está dissecando para evitar detritos confuso com o tecido desejado explantado.
3. Quando explantes revestimento em poços ou em lamelas se esqueça de colocar gota de mídia com explante no centro de bem.
4. Permitir explantar tempo suficiente para prender antes de inundar o bem com a mídia.
5. Condições de tratamento deve ser padronizado para cada substrato de teste e agente farmacológico usado.
6. Dois explantes podem ser feitas a partir de cada embrião (um do lado esquerdo e uma do lado direito do tubo neural).
7. Ao testar a migração de células a partir de linhas de ratinhos mutantes em diferentes condições experimentais, colocar um explante mutante no grupo de controlo e outro do grupo tratado.

Solução de problemas

1. Se explantes não anexar, aumentar o tempo previsto para a fixação. Na nossa experiência, cerca de metade dos explantes não atribuem e explantes maiores aderir de forma mais eficiente.
2. Se explantes anexar a periferia do poço que será difícil de imagem. Certifique-se de colocar explantes no centro do poço.
3. Idealmente explantes serão de aproximadamente o mesmo tamanho. No entanto, diferenças no tamanho do explante pode ser corrigido para a utilização do diâmetro dos explantes como um factor de correcção, quando quanitating migrações de células a partir de explantes.
4. Se ocorrer contaminação ter certeza estéreis as condições de trabalho estão sendo usados. Todas as ferramentas e superfícies de trabalho devem ser esterilizados com etanol a 70%. Pipetas e placas de Petri devem ser nova e estéril.
5. Se explantes estão se perdendo durante a dissecção, periodicamente, remover detritos para evitar a perda de explante.
6. Dominando a dissecção é demorado e requer prática. Optimal ampliação, afiados instrumentos de dissecação e ajuda de agulhas.

Resultados

O aparecimento de células que migram a partir de explantes de mesênquima crânio é mostrado na Figura 2. Testamos a migração em vários substratos ECM que estão presentes no mesênquima craniana durante neurulação incluindo fibronectina (100 mg / ml, Sigma # F1141), laminina (100 mg / ml, Sigma # L2020), ECM MaxGel (diluição 1:500 em DMEM ; Sigma # E0282) e ácido hialurónico (1 mg / ml, Sigma, # 53747). Células não migrar do explante, quando não está presente ECM (dados não mostrados) e de todos os substratos testados migração das células suportado. Tanto a forma como o bem como o tamanho das células que migram a partir dos explantes depende do substrato. Isto é esperado que os estudos prévios demonstraram que as forças mecânicas geradas pela interacção das células com a ECM diferente afetar tanto a forma e as propriedades das células migratórias ^21.

Figura 1. Preparação de explantes. (A) Para preparar explantes, E8.5 embriões são dissecados de deciduas e tecidos extraembryonic. (B) as cabeças de Embriões são dissecados a partir do corpo anterior aos rhombomeres. Os explantes são preparados por remoção de tecido a partir da linha média e os bordos exteriores da cabeça de remover a placa precordial na linha média e a crista neural e premigratory ectoderma superficial na fronteira, respectivamente. (C) Os explantes são preparadas cortando-se o tecido a partir das bordas da linha média e exterior da cabeça de remover a placa precordial na linha média e a crista neural e premigratory ectoderma superficial nas fronteiras. (D) Os explantes são colocados em um pequeno volume de meio em placas revestidas com MEC / lamelas e deixadas a ligar, antes da adição de mais mídia.

Figura 2. Explantes de migração das células mesenquimais do crânio a partir de explantes, semeadas em diferentes substratos. Foram semeadas em fibronectina, laminina, ECM MaxGel ou ácido hialurónico e fotografadas após 48 h em cultura. Barra size = 200 mm.

Discussão

O método aplicado aqui proporciona um ensaio poderoso para examinar o comportamento das células mesenquimais cranianos. Além das análises estáticas aqui apresentados, ao vivo, em experimentos com imagens de campo claro ou em combinação com a expressão de proteínas marcadas com GFP pode ser utilizado para analisar o comportamento de células em tempo real à medida que migram a partir do explante. Para as experiências de imagens ao vivo, os explantes podem ser rotulados com DiI ou para diferenciar a migração de crista neural da mesoderme paraxial, ROSA-YFP; Mesp1-cre ou ROSA-YFP; Wnt1-cre ou outras linhas transgénicas poderiam ser utilizados. Cranianos mesênquima ECM interações também podem ser examinados utilizando este ensaio explante. Aqui nós explantes placa em substratos diferentes de ECM que estão presentes no mesênquima craniana para mostrar que as células migram sobre estes a diferentes graus, e que a ECM influencia a morfologia das células. Além disso, os explantes podem ser incorporados numa matriz tridimensional para acessar os comportamentos de cells neste contexto. Este ensaio de explante pode ser alterada para análise do efeito de manipulações genéticas e farmacológicas sobre comportamentos mesênquima cranianos para analisar sinais intrínsecas e extrínsecas que podem regular a migração e modificar. Por exemplo, utilizou-se este ensaio em nossos estudos de discernir a função de secreção de Hsp90 em excesso nos comportamentos anormais celulares em Hectd1 mesênquima mutante craniana ^15. Nestas experiências, foram tratados explantes com anticorpo anti-Hsp90, Hsp90 proteínas, geldanamicina e DMA (amelioride dimetil) para bloquear a secreção de Hsp90 para demonstrar que o comportamento anormal de células mutantes Hectd1 é devido ao excesso de Hsp90 extracelular ^15. Uma abordagem semelhante pode ser usada para dissecar farmacologicamente vias adicionais subjacentes morfogénese normal ou anormal do mesênquima cranial. Uma vez que o ensaio é completado, os explantes e células migratórias podem ser analisados ​​por uma série de métodos. Por exemplo, c análises imuno-histoquímicaum ser empregue para examinar a localização de proteínas críticas para a circulação de células. Análises de transcriptoma poderia também ser utilizado para determinar como os tratamentos afecta a expressão do gene.

Uma limitação significativa desta técnica é a de que ele não comportamentos modelo em três dimensões, como eles ocorrem in vivo. Modificação do protocolo de explantes onde são incorporados em uma matriz tridimensional (eg matrigel), juntamente com a expressão da proteína fluorescente marcadas compartimentos celulares poderia ser empregada necessária para resolver este problema. Mesmo se estas modificações foram realizadas experiências adicionais para correlacionar comportamentos observados neste ensaio ex vivo com os in vivo seria necessário. Outras limitações incluem o grande número de embriões necessários para gerar números suficientes para gerar dados significativos estatisticamente. Mais importante ainda, a dissecção é relativamente simples, mas exige prática para dominar.