Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Resumo

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Resumo

A morte celular programada (PCD) ocorre em adultos para manter a homeostase do tecido normal e durante o desenvolvimento embrionário de moldar os tecidos e órgãos ^1,2,6,7. Durante o desenvolvimento, produtos químicos tóxicos ou alterações genéticas podem causar um aumento na PCD ou mudar os padrões de PCD, resultando em anomalias do desenvolvimento e defeitos de nascimento ^3-5. Para compreender a etiologia de tais defeitos, o estudo de embriões podem ser complementados com os ensaios in vitro que utilizam diferenciação estaminais embrionárias (ES) células.

A apoptose é uma forma bem estudado de PCD que envolve tanto intrínsecos e extrínsecos de sinalização para ativar a enzima caspase cascata. Alterações celulares características incluem blebbing membrana, encolhimento nuclear, e fragmentação de DNA. Outras formas de PCD não envolvem a activação das caspases e pode ser o resultado final de autofagia prolongada. Independentemente da via de PCD, as células que morrem precisam de ser removidos. Em adultos, as células do sistema imunológico performe esta função, enquanto que em embriões, em que o sistema imune não desenvolveu ainda, a remoção ocorre por um mecanismo alternativo. Este mecanismo envolve as células vizinhas (chamados "não profissionais fagócitos") assumindo um papel-fagocítica eles reconhecem o 'me comer' sinal na superfície da célula a morrer e que engolem ^8-10. Após imersão, os detritos é trazido para o lisossoma pela degradação. Assim, independentemente do mecanismo de PCD, um aumento da actividade lisossomal pode ser correlacionada com o aumento da morte celular.

Para estudar PCD, um ensaio simples de visualizar lisossomas em tecidos espessos e culturas de multicamadas de diferenciação pode ser útil. Corante Lyso Tracker é uma molécula altamente solúvel pequeno que é retido na ácidas compartimentos subcelulares, tais como a ^11-13 lisossoma. O corante é absorvido por difusão e através da circulação. Uma vez que a penetração não é um obstáculo, visualização de CPD nos tecidos espessos e multi-camada de culturas é possível ^12,13 14, está limitado a pequenas amostras, secções histológicas, e as culturas de monocamada, porque o processo requer a entrada / permeabilidade de uma transferase terminal.

Em contraste com o azul de anilina, que difunde e é dissolvido por solventes, Lyso Tracker Red DND-99 é corrigível, brilhante e estável. A coloração pode ser visualizado com microscopia de fluorescência confocal ou padrão em montagem integral ou seção usando aquosas ou base solvente meios de montagem ^12,13. Aqui descrevemos protocolos utilizando o corante de olhar para PCD no normal e Sonic Hedgehog embriões de camundongos nulos. Além disso, demonstramos análise de PCD em diferenciar as culturas de células ES e apresentar um método de quantificação simples. Em resumo, coloração Lyso Tracker pode ser um ótimo complemento para outros métodos de detecção de PCD.

Protocolo

1. Coloração Lyso Tracker de embriões de camundongos

1. Gerar embriões de ratos, colocando jovens (5-6 semanas de idade) fêmeas em gaiolas do parafuso prisioneiro do sexo masculino. Monitorar nas manhãs seguintes para o aparecimento de um rolhão vaginal indicando que o acasalamento ocorreu. Se a mulher está grávida, meio-dia em que dia é chamado de 0,5 dpc (dias coito post). O procedimento aqui apresentado é ideal para embriões 7-13 DPC.
2. No dia embrionário de interesse, a eutanásia fêmea de acordo com os protocolos aprovados e remover o útero. Remoção dos embriões a partir da decidua em uma placa de 10 cm de Petri com Hanks BSS (sem vermelho de feno....

Discussão

Características importantes da apoptose incluem a detecção de danos no DNA, com o ensaio de TUNEL, juntamente com a detecção da actividade da caspase (detectada com mAbs ou uma molécula de ligação, tal como zVAD-fmk), a observação das modificações celulares, bem como a apresentação de fosfatidilserina (PS ) na superfície da membrana (detectado pela aderência à anexina V). Existem algumas desvantagens com cada um destes ensaios. Por exemplo, a transferase terminal utilizado no ensaio de TUNEL não penetra para além alguma.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia		Número de catálogo
Lyso Tracker Red DND-99	Invitrogen	# L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldeído	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VETOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013 CV-
Não-aminoácidos essenciais	Cellgro	25-025 CI-
Piruvato de sódio	Cellgro	25-000 CI-
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-mercaptoetanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II lâminas Câmara (8 poços)	Nalge Nunc International	154534
Gelatina a 0,1%	Millipore	ES-006-B
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Cellgro	21-031 CV-
			Receitas solução Paraformaldeído a 4% Para 100 ml: Misture paraformaldeído a 4 g, 90 ml de H 2 O, e NaOH (uma gota de NaOH 2N). O paraformaldeído não vou entrar em solução até ter adicionado alguns NaOH para aumentar o pH. Agita-se e aquece-se a 60 ° C até todo o pó se encontra em solução (~ 10-20 minutos). Não sobreaquecer. Adicionar ~ 10 ml de PBS 10x para atingir um volume final de 100 ml. Armazenar a -20 ° C em conveniente (~ ~ 10 ml ou 40 ml) de alíquotas. AVISO: Paraformaldeído em 'babado' forma (comprimido pequenas pelotas) é menor em pó e pode, portanto, ser medido fora de um capuz. No entanto, você ainda deve usar uma máscara protetora contra poeira (N95pelo menos) durante o manuseamento. EB Meios de Cultura Para 500 ml EB Media: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamina: 5,0 ml De penicilina / estreptomicina: 5,0 ml Não-aminoácidos essenciais: 5,0 ml Piruvato de sódio: 5,0 ml β-mercaptoetanol: 500ul