Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Resumo

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Resumo

A morte celular programada (PCD) ocorre em adultos para manter a homeostase do tecido normal e durante o desenvolvimento embrionário de moldar os tecidos e órgãos ^1,2,6,7. Durante o desenvolvimento, produtos químicos tóxicos ou alterações genéticas podem causar um aumento na PCD ou mudar os padrões de PCD, resultando em anomalias do desenvolvimento e defeitos de nascimento ^3-5. Para compreender a etiologia de tais defeitos, o estudo de embriões podem ser complementados com os ensaios in vitro que utilizam diferenciação estaminais embrionárias (ES) células.

A apoptose é uma forma bem estudado de PCD que envolve tanto intrínsecos e extrínsecos de sinalização para ativar a enzima caspase cascata. Alterações celulares características incluem blebbing membrana, encolhimento nuclear, e fragmentação de DNA. Outras formas de PCD não envolvem a activação das caspases e pode ser o resultado final de autofagia prolongada. Independentemente da via de PCD, as células que morrem precisam de ser removidos. Em adultos, as células do sistema imunológico performe esta função, enquanto que em embriões, em que o sistema imune não desenvolveu ainda, a remoção ocorre por um mecanismo alternativo. Este mecanismo envolve as células vizinhas (chamados "não profissionais fagócitos") assumindo um papel-fagocítica eles reconhecem o 'me comer' sinal na superfície da célula a morrer e que engolem ^8-10. Após imersão, os detritos é trazido para o lisossoma pela degradação. Assim, independentemente do mecanismo de PCD, um aumento da actividade lisossomal pode ser correlacionada com o aumento da morte celular.

Para estudar PCD, um ensaio simples de visualizar lisossomas em tecidos espessos e culturas de multicamadas de diferenciação pode ser útil. Corante Lyso Tracker é uma molécula altamente solúvel pequeno que é retido na ácidas compartimentos subcelulares, tais como a ^11-13 lisossoma. O corante é absorvido por difusão e através da circulação. Uma vez que a penetração não é um obstáculo, visualização de CPD nos tecidos espessos e multi-camada de culturas é possível ^12,13 14, está limitado a pequenas amostras, secções histológicas, e as culturas de monocamada, porque o processo requer a entrada / permeabilidade de uma transferase terminal.

Em contraste com o azul de anilina, que difunde e é dissolvido por solventes, Lyso Tracker Red DND-99 é corrigível, brilhante e estável. A coloração pode ser visualizado com microscopia de fluorescência confocal ou padrão em montagem integral ou seção usando aquosas ou base solvente meios de montagem ^12,13. Aqui descrevemos protocolos utilizando o corante de olhar para PCD no normal e Sonic Hedgehog embriões de camundongos nulos. Além disso, demonstramos análise de PCD em diferenciar as culturas de células ES e apresentar um método de quantificação simples. Em resumo, coloração Lyso Tracker pode ser um ótimo complemento para outros métodos de detecção de PCD.

Protocolo

1. Coloração Lyso Tracker de embriões de camundongos

1. Gerar embriões de ratos, colocando jovens (5-6 semanas de idade) fêmeas em gaiolas do parafuso prisioneiro do sexo masculino. Monitorar nas manhãs seguintes para o aparecimento de um rolhão vaginal indicando que o acasalamento ocorreu. Se a mulher está grávida, meio-dia em que dia é chamado de 0,5 dpc (dias coito post). O procedimento aqui apresentado é ideal para embriões 7-13 DPC.
2. No dia embrionário de interesse, a eutanásia fêmea de acordo com os protocolos aprovados e remover o útero. Remoção dos embriões a partir da decidua em uma placa de 10 cm de Petri com Hanks BSS (sem vermelho de fenol). Remover as membranas extra-embrionárias e que pelo menos uma lavagem com Hanks BSS para remover tecidos estranhos e sangue.
3. Prepare Lyso Tracker solução de coloração Embrião (5 Lyso Tracker mM em Hanks BSS). Um volume conveniente para 1-2 litros é de 5 ml. Misture delicadamente para desembolsar o corante uniformemente.
4. Adicionar embriões para o solut coloração Lyso Tracker Embriãoion em um tubo de microcentrífuga ou frasco e incubar a 37 ° C durante 45 min.
5. Enxágüe muito delicadamente em Hanks BSS quatro vezes, 5 min cada lavagem.
6. Fixar em paraformaldeído 4% durante a noite.
7. Enxaguar uma vez em Hanks BSS, 10 min, para remover a solução.
8. Desidratar através de uma série de metanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min cada passo) para eliminar a coloração de fundo. Isto é importante para alcançar um bom sinal-para-ruído de imagem durante a.
9. Neste ponto, é possível armazenar as amostras de embrião indefinidamente em metanol à temperatura de -20 ° C, protegida da luz.

Nota: Uma amostra de tecido pode ser tomada em qualquer passo para a genotipagem de DNA, no entanto, pode ser mais conveniente para retirar uma amostra imediatamente antes de armazenamento, de modo que até esta etapa todas as amostras podem ser processadas em lotes. Recolher uma amostra de tecido a partir da cauda, ​​membros, ou a cabeça de cada embrião e colocar tudo em tubos separados. Hidratar a amostra de tecido e se preparar para genotyping.

2. Coloração Lyso Tracker de diferenciar culturas ES

1. Preparar corpos embrióides através da suspensão da gota Método ^15, com uma densidade inicial de 500 células por 20 ul de gota.
2. Após 3 dias, transferir os corpos embrióides de cultura em suspensão em 10 centímetros não aderentes pratos de Petri (isto é, aqueles utilizados para o trabalho bacteriológica). Cultura por 5 dias, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias.
3. No dia 7, transferir os corpos embrióides de lâminas gelatinizadas oito poços de câmara (adicionar 0,1% de gelatina para as câmaras, espere 5 minutos, remover e adicionar mídia). Transferência 1-2 corpos embrióides por câmara.
4. Cultura por 10 dias, mudando de mídia todos os dias. Ter o cuidado de colocar a pipeta no canto da lâmina de câmara de modo a não perturbar o corpo embryoid fixação à superfície de vidro. Além disso, quando a adição de meio fresco também colocar a pipeta no canto da câmara, e soltar o material lentamente.
5. Após 10 dias de cultoure, para induzir a apoptose, como controlo positivo, tratar alguns dos poços com 0,1 mM e 1,0 mM de H ₂ O ₂ (adicionar o H ₂ O ₂ para meios frescos, mistura, em seguida, adicionar às células) durante 60 min. Lavar duas vezes com D-PBS durante a noite e a cultura em meios normais.
6. Aspirar cuidadosamente meios existentes e adicionar Lyso Tracker solução de coloração celular (500 Lyso Tracker nM (concentração final), em media, 300 ul por câmara).
7. Incubar a 37 ° C durante 15 min.
8. Lavar duas vezes com 2 vezes D-PBS, 5 min cada.
9. Fixar em paraformaldeído a 4% durante 15 min a RT.
10. Lavar duas vezes com D-PBS, 5 min.

3. Visualizando Embriões Lyso Tracker manchados ou culturas ES

1. Preparar as amostras de células para microscopia aspirando o D-PBS; remover a câmara fora do slide, secagem ao ar durante cerca de 5 min, e em seguida a adição de um meio aquoso de montagem (Vectashield com DAPI ou similar). Coloque uma folha de barreira, enquanto drying para diminuir o branqueamento do fluoróforo. Monte embriões em um prato de vidro depressão profunda ou placa de Petri pequena Vectashield ou similar.
2. Visualizar com um microscópio de dissecção ou composto equipado com uma rodamina ou vermelho Texas filtro (Lyso Tracker RED DND-99, excitação / emissão: 577/590 nm). A coloração é tipicamente muito brilhante para longas exposições normalmente não são necessário.

4. Quantificação dos resultados usando técnicas de imagem

1. Tire fotos digitais de suas amostras nas condições de exposição mesmo em modo manual.
2. Abra as imagens no Adobe Photoshop ou um programa de imagem semelhante. Para determinar a quantidade de coloração de Lyso Tracker, seleccionar o canal vermelho e do limiar da imagem (converte a imagem em preto e branco) de tal forma que a coloração vermelha é agora representado por pixels brancos. Seleccionar os pixels brancos, e utilizar a função de histograma para obter a contagem total.
3. Use o canal azul para contaro número de núcleos no campo. Ele pode ser útil para manter um registro da contagem, anotando a imagem.
4. Registre os valores e calcular o nível de coloração média por celular. Repita esta análise com a configuração de limite mesmo para todas as imagens que pretende provar.

5. Resultados representativos

Há um padrão normal de PCD durante o desenvolvimento embrionário, que pode mudar quando um gene do factor de crescimento, tal como o Sonic hedgehog (Shh), é removido ^16,17. Uma vez que é um corante Lyso Tracker pequena molécula que é altamente difusível, o embrião inteiro pode ser visualizado para avaliar as áreas de PCD mesmo profundamente dentro do mesênquima ^12,13 A Figura 1 mostra o padrão de coloração para Lyso Tracker normais e Shh ^{-. / -} Embriões de ratos mutantes no 10.5dpc. Nesta fase, PCD é grandemente aumentada em Shh ^{- / -} embriões mutantes, particularmente no membro e regio somitons. Partes do embrião pode ser trabalhada em toda montagem em maior ampliação (1B) para avaliar o padrão global. Porções dissecadas também pode ser seccionado em micrótomo vibrando (1C) ou um criostato (DF) para revelar as regiões de PCD em maior detalhe.

Análise TUNEL é melhor feita em secções finas em que a penetração da transferase terminal é menos problemático. Coloração Lyso Tracker e um ensaio de TUNEL pode ser feita no mesmo tecido (Figura 1D-G). Estes resultados mostram que, apesar de não existir uma correlação estreita entre 01:01 e Lyso Tracker coloração TUNEL, as regiões de sobreposição gerais PCD consideravelmente. Numa ampliação mais elevada, é possível ver que puncta coloração positiva com o ensaio de TUNEL, mas não com o corante Lyso Tracker, puncta que mancha única com o corante Lyso Tracker, e que se sobrepõem puncta coloração.

Quando uma EB é chapeada sobre uma superfície revestida de gelatina, as células diferenciam irá migrate para fora. Após 10 dias de cultura, as células foram diferenciadas em uma variedade de tipos de células incluindo neurónios, células musculares, e cardiomiócitos. As culturas apresentadas na Figura 2 contêm populações mistas destes tipos de células, no entanto pode-se adaptar a protocolo para estudar a CPD de um determinado tipo de células de interesse. Por exemplo, a EB pode ser tratado com ácido retinóico para melhorar a diferenciação de neurónios ^19, e, em seguida, o ensaio de Lyso Tracker poderia ser utilizado para avaliar a morte de células neuronais em diferentes condições. Na cultura normal de células ES diferenciadas, existem algumas células que passam por PCD e estes podem ser detectados com Lyso Tracker e / ou ensaios de TUNEL (Figura 2A). PCD pode ser induzida por um número de diferentes agentes citotóxicos, tais como o peróxido de hidrogénio (H ₂ O _2), que induz danos oxidativos e inicia a via apoptótica ^20,21. Uma dose baixa de H ₂ O ₂ aumenta tantoLyso Tracker e coloração TUNEL em comparação com nenhum tratamento, enquanto que resulta uma dose elevada de encolhimento celular e Lyso Tracker generalizada e positividade TUNEL. De forma semelhante aos resultados em que o embrião, é possível ver que puncta coloração positiva com o ensaio de TUNEL, mas não com o corante Lyso Tracker, puncta que mancha única com o corante Lyso Tracker, e que se sobrepõem puncta coloração. A consequência da aplicação de um agente citotóxico que induz a apoptose é comparado com as condições que induzem a privação de soro autofagia (Figura 2D). Células que tenham sido submetidos a um período de privação de soro (1 hora) exibem um padrão diferente, onde Lyso Tracker e coloração TUNEL não correlacionam. Coloração Lyso Tracker é muito maior em comparação com culturas não tratadas, contudo TUNEL positivo é em níveis normais.

Empregando ferramentas padrão disponíveis no Adobe Photoshop, coloração Lyso Tracker pode ser quantificada com um método simples limiarizaçãoque permite calcular o nível de coloração média para uma população de células. Figura 3A-B mostra como a imagem da amostra parece durante o processo de quantificação. Começando com uma imagem de linha de base com coloração Lyso Tracker no canal vermelho e os núcleos DAPI-manchado no canal azul (painel 3A), o canal vermelho da imagem foi limiarizadas para converter a imagem em preto-e-branco e os pixels brancos eram então selecionadas e contadas (Figura 3A). Um nível de limiar foi escolhido que representa o padrão de coloração Lyso Tracker. Como acontece com qualquer método de quantificação que usa imagens, é importante para evitar a superexposição suas fotos como esta poderia resultar em mais-enfatizar as diferenças. O número de núcleos no campo podem então ser contadas olhando apenas o canal azul (Figura 3B) e a marcação dos núcleos utilizando uma ferramenta de desenho, tal como um pincel, enquanto a contagem (Figura 3B). Pode-se, em seguida, expressar thnível e de coloração por meio do cálculo do nível médio de manchas por célula (número de pixels de contagem de núcleos /). Se se quiser usar esse algoritmo para rastreio através put-alta, a maioria dos pacotes de triagem pode medir o brilho em um canal específico e também ter uma função identificador do objeto que contará núcleos em um campo, no entanto, para a maioria das aplicações típicas do método manual é rápido e simples. Para dar um exemplo, uma região de amostra a partir das Figuras 2A-C foi quantificada e os resultados confirmam que o aumento das concentrações de H ₂ O _2, resulta num maior nível de coloração Lyso Tracker (Figura 3C).

Figura 1. Coloração Lyso Tracker em normais e Shh ^- embriões ^{- /.} A, A 'Normal e Shh ^{-. / -} Embriões de camundongos em 10,5 dpc, corados com Lyso Tracker Vermelho, montado em Vectashield e fotografados emum microscópio de dissecção epiflourescence. Os parênteses indicam a localização dos membros anteriores B, B 'de Membro Anterior normais e Shh ^{-.. / -} Embriões fotografada na maior ampliação. Note os domínios de morte das células normais, incluindo a "Zona Posterior Necrotic '(marcada com um asterisco) e uma região no mesênquima proximal do botão do membro (marcada com uma seta). Membros nulos Shh exibem forte coloração na porção média e distal . C, C '. seções medial através do broto forelimb de brotos de membros normais e nulo. Observe a presença de manchas no mesênquima proximal (seta) e AER (seta) do botão do membro normal ea coloração forte dentro do mesênquima dorsal e ventral e distal dentro do broto de membro nulo. DF. A mesma seção (12 mícron, congelados seção) foi fotografada por Lyso Tracker e coloração TUNEL (Roche 1.684.795). A secção de passa através da porção distai do nulo Shh mesenchyme. Seta aponta para a AER. Note-se como o padrão geral é muito semelhante, usando os dois métodos, no entanto, a coloração não se sobreponha completamente. G, G '. Numa ampliação mais elevada do AER e mesênquima, pode-se ver tanto a presença de pontos lacrimais que são Lyso Tracker ou TUNEL positivo Apenas assim como puncta que se sobrepõem a coloração.

Figura 2. Lyso Tracker coloração em células ES diferenciadas. Diferenciando células foram semeadas em oito lâminas de câmara, na ausência de LIF. Para mostrar como Lyso Tracker e coloração TUNEL comparar, a via de apoptose foi induzida com 2 doses diferentes de H ₂ O _2, enquanto a via autophagy foi induzida com 1 hora de privação de soro. Estas imagens foram tiradas com um microscópio Zeiss Confocal LSM5 A-A'':. Culturas não tratadas mostram alguma apoptose normal, tal como indicado pela LysoTracker e coloração TUNEL. O padrão de ambas as técnicas em sua maioria sobreposições (setas brancas), no entanto, pode-se ver um puncta poucos que são Lyso Tracker positivas (setas vermelhas) B-B'', CC ":. Tratamento com quantidades crescentes de H ₂ O ₂ estimula a apoptose . A dose mais baixa mostra mais Lyso Tracker e puncta TUNEL positivo quando comparadas com as células não tratadas. A dose mais elevada induz em Lyso Tracker ainda mais e puncta TUNEL positivo. setas apontam para a coloração branca sobreposta, enquanto as setas vermelhas apontam para puncta que são positivos para apenas Lyso Tracker. É também possível ver puncta que são apenas positivo para a coloração TUNEL (setas verdes) DD ":. inanição de soro pode induzir autofagia, que pode estimular uma acumulação de material nos lisossomas e autophagolysosomes. Observe quantos mais pontos lacrimais Lyso Tracker são visíveis em comparação com culturas não tratadas. TUNEL puncta positiva estão presentes (a maioria dos quais se sobrepõem Lyso Tracker manchação, as setas brancas), no entanto, que o número não é grandemente aumentada em comparação com as condições não tratadas. Além disso, sob condições de privação de soro, Lyso Tracker somente puncta positivo são altamente prevalentes (setas vermelhas).

Figura 3. Método de quantificação para avaliar o nível de coloração, numa população de células, utilizando o Adobe Photoshop. A: Uma porção da Figura 2A foi escolhido eo Lyso Tracker (canal vermelho) e coloração DAPI (núcleos, azul canal) é mostrado neste painel A ':. O canal vermelho da Figura 3A foi limiarizadas para convertê-lo a um preto-e -branco. Os pixels brancos, podem então ser seleccionados e contados utilizando a função de histograma B-B ':. O canal azul mostra os núcleos e, enquanto a contagem deles, a imagem pode ser anotado com uma função de desenho, tal como um pincel C:. Isto é um ex-quantificação amplo de uma amostra a partir de painéis 2A-C. Os dados são representados como pixels por núcleos. Clique aqui para ver maior figura .

Discussão

Características importantes da apoptose incluem a detecção de danos no DNA, com o ensaio de TUNEL, juntamente com a detecção da actividade da caspase (detectada com mAbs ou uma molécula de ligação, tal como zVAD-fmk), a observação das modificações celulares, bem como a apresentação de fosfatidilserina (PS ) na superfície da membrana (detectado pela aderência à anexina V). Existem algumas desvantagens com cada um destes ensaios. Por exemplo, a transferase terminal utilizado no ensaio de TUNEL não penetra para além alguma...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia		Número de catálogo
Lyso Tracker Red DND-99	Invitrogen	# L-7528
Hanks BSS	Invitrogen	14025-076
Paraformaldeído	EMD	EM-PX0055-3
Vectashield	VETOR	H-1200
DMEM	Cellgro	10-013 CV-
Não-aminoácidos essenciais	Cellgro	25-025 CI-
Piruvato de sódio	Cellgro	25-000 CI-
FBS	Hyclone	SH30071.02
Pen-Strep	Invitrogen	15140-122
b-mercaptoetanol, 50 mM	Invitrogen	21985-023
LabTek-II lâminas Câmara (8 poços)	Nalge Nunc International	154534
Gelatina a 0,1%	Millipore	ES-006-B
PBS de Dulbecco (D-PBS)	Cellgro	21-031 CV-
			Receitas solução Paraformaldeído a 4% Para 100 ml: Misture paraformaldeído a 4 g, 90 ml de H 2 O, e NaOH (uma gota de NaOH 2N). O paraformaldeído não vou entrar em solução até ter adicionado alguns NaOH para aumentar o pH. Agita-se e aquece-se a 60 ° C até todo o pó se encontra em solução (~ 10-20 minutos). Não sobreaquecer. Adicionar ~ 10 ml de PBS 10x para atingir um volume final de 100 ml. Armazenar a -20 ° C em conveniente (~ ~ 10 ml ou 40 ml) de alíquotas. AVISO: Paraformaldeído em 'babado' forma (comprimido pequenas pelotas) é menor em pó e pode, portanto, ser medido fora de um capuz. No entanto, você ainda deve usar uma máscara protetora contra poeira (N95pelo menos) durante o manuseamento. EB Meios de Cultura Para 500 ml EB Media: DMEM: 404,5 ml FBS: 75,0 ml L-Glutamina: 5,0 ml De penicilina / estreptomicina: 5,0 ml Não-aminoácidos essenciais: 5,0 ml Piruvato de sódio: 5,0 ml β-mercaptoetanol: 500ul