Examinando BCL-2 Função Família com grandes vesículas unilamelares

Resumo

Vesículas unilamelares grandes (LUVs) bioquimicamente definidas são um sistema modelo conveniente para analisar as interações da família BCL-2, com implicações diretas na melhor compreensão da via mitocondrial da apoptose. Apresenta-se um método para produção de LUVs, juntamente com combinações padrão de proteínas da família BCL-2 e controles para examinar a permeabilização de LUVs.

Resumo

A família BCL-2 (linfoma de células B CLL/linfoma) é composta por aproximadamente vinte proteínas que colaboram para manter a sobrevivência celular ou iniciar a apoptose¹. Após estresse celular (por exemplo, dano ao DNA), os efetores pró-apoptóticos da família BCL-2, BAK (mortal antagonista de BCL-2 1) e/ou BAX (proteína associada a BCL-2 X), são ativados e comprometem a integridade da membrana mitocondrial externa (MME), por meio do processo denominado permeabilização da membrana mitocondrial externa (MME)¹. Após a ocorrência da MME, proteínas pró-apoptóticas (por exemplo, citocromo c) ganham acesso ao citoplasma, promovem a ativação de caspases e a apoptose ocorre rapidamente².

Para que BAK/BAX induzam a MOMP, eles requerem interações transitórias com membros de um outro subconjunto pró-apoptótico da família BCL-2, as proteínas somente do domínio de homologia BCL-2 (BH3), como BID (agonista do domínio interativo BH3)^3-6. As proteínas da família BCL-2 antiapoptóticas (por exemplo, gene relacionado à BCL-2, isoforma longa, BCL-xL; leucemia de células mieloides 1, MCL-1) regulam a sobrevivência celular controlando rigorosamente as interações entre BAK/BAX e as proteínas somente BH3 capazes de induzir diretamente a ativação de BAK/BAX^7,8. Além disso, a disponibilidade das proteínas BCL-2 antiapoptóticas também é determinada pelas proteínas sensibilizadoras/desrepressoras somente BH3, como BAD (antagonista da morte celular BCL-2) ou PUMA (modulador da apoptose regulado por p53), que se ligam e inibem membros antiapoptóticos^7,9. Como a maior parte do repertório de BCL-2 antiapoptótica está localizado na MMO, a decisão celular entre manter a sobrevivência ou induzir a MOMP é determinada por múltiplas interações da família BCL-2 nesta membrana.

Vesículas unilamelares grandes (VULCs) são um modelo bioquímico para explorar as relações entre as interações da família BCL-2 e a permeabilização da membrana¹⁰. As LUVs são compostas por lipídios definidos que são montados em proporções identificadas em estudos de composição lipídica a partir de mitocôndrias de Xenopus extraídas com solvente (46,5% fosfatidilcolina, 28,5% fosfatidiletanolamina, 9% fosfatidilinositol, 9% fosfatidilserina e 7% cardiolipina)¹⁰. Este é um sistema modelo conveniente para explorar diretamente a função da família BCL-2, pois os componentes proteicos e lipídicos são completamente definidos e passíveis de manipulação, o que nem sempre ocorre com mitocôndrias primárias. Embora a cardiolipina normalmente não esteja presente em concentrações tão elevadas em toda a membrana mitocondrial externa (OMM), este modelo imita fielmente a OMM para promover a função da família BCL-2. Além disso, uma modificação mais recente do protocolo descrito permite análises cinéticas de interações proteicas e medidas em tempo real da permeabilização da membrana, baseadas em LUVs contendo um corante policatiônico (ANTS: 8-aminonaftaleno-1,3,6-trissulfônico) e um quenchador catiônico (DPX: p-xileno-bis-piridínio brometo)¹¹À medida que as LUVs se tornam permeáveis, ANTS e DPX difundem-se separadamente, e um aumento na fluorescência é detectado. Aqui, são descritas combinações comumente utilizadas de proteínas recombinantes da família BCL-2 e controles empregando LUVs contendo ANTS/DPX.

Protocolo

1. Combine lipídios e crie um filme lipídico

1. Trabalhando em uma capela com iluminação mínima, lipídios solubilizados em clorofórmio são combinados em um frasco âmbar de vidro de 1,5 ml utilizando uma seringa de vidro estanque ao gás Hamilton previamente lavada com clorofórmio. Essa combinação produzirá aproximadamente 4 mg de lipídio (Figura 1A).
   • Cardiolipina 10 mg/ml (CL) - 63 μl
   • Fosfatidilcolina 10 mg/ml (PC) - 84 μl
   • Fosfatidiletanolamina 10 mg/ml (PE) - 125 μl
   • Fosfatidilinositol 10 mg/ml (PI) - 59,5 μl
   • Fosfatidilserina 10 mg/ml (PS) - 65 μl
2. Para remover o clorofórmio, aplique um fluxo suave de um gás inerte (por exemplo, nitrogênio ou argônio) no frasco. Um filme lipídico se tornará visível no fundo e nas laterais do frasco quando estiver seco, o que normalmente leva de 2 a 3 horas (Figura 1A).

2. Preparar Solução de Lipossomos

1. Em tubos microcentrífugos de 1,7 ml, prepare 500 μl de ANTS 12,5 mM no tampão LUV (0,2 mM EDTA, 10 mM HEPES [pH 7], 200 mM KCl, 5 mM MgCl₂ ) e 500 μl de DPX 45 mM no tampão LUV (Figura 1B).
2. Misture as soluções de ANTS e DPX, vortexie por 1 minuto e sonique por 1 minuto à temperatura ambiente. A sonicação é realizada em um banho de ultrassom aquoso (por exemplo, Branson 3510MTH, sem ajuste, apenas ligado). Isso garante que as soluções estejam completamente solubilizadas e homogêneas.
3. Adicione a solução de ANTS/DPX ao filme lipídico e feche o frasco com parafilm (Figura 1B).
4. Sonique o filme lipídico no banho aquoso descrito acima por 5 minutos. A solução apresentará aparência leitosa após a sonicação. Certifique-se de que o filme lipídico esteja completamente solubilizado, pois agregados lipídicos pequenos afetarão negativamente as etapas subsequentes. Além disso, verifique as laterais e a base do frasco para garantir que não reste filme lipídico (Figura 1B).

3. Extrusão e Purificação de Lipossomos

1. Monte o extrusor de acordo com as orientações do fabricante, utilizando o tampão LUV para umedecer os suportes do filtro e a membrana de policarbonato. Aperte o invólucro do equipamento para que não haja perda de volume durante a extrusão, mas sem exagerar a ponto de romper a membrana. Também é recomendável testar o extrusor com o tampão LUV para garantir que não haja vazamentos ou problemas.
2. Inicie com a solução lipídica na seringa da direita e realize a extrusão da solução lipídica 31 vezes; ao final, as LUVs estarão na seringa da esquerda. Isso garante que todos os lipídios tenham atravessado a membrana pelo menos uma vez. Nas primeiras passagens, pode ser necessário um pouco mais de pressão para atravessar a membrana. Se a solução passar subitamente pela membrana com rapidez, verifique se houve ruptura e substitua a membrana, se necessário (Figura 1C).
3. Monte uma coluna de Sepharose S-500 de fluxo por gravidade com volume de 10 ml (1,0 cm x 20 cm, volume de 10 ml de perlas). Lave com 3 volumes da coluna de tampão LUV, deixe o fluxo parar e tampe a coluna. Como este passo leva algum tempo, é preferível iniciar a lavagem enquanto os lipídios estão sendo secos. Mantenha a coluna tampada até o momento de utilizá-la.
4. Adicione as LUVs extrudidas à coluna em um único passo, evitando perturbar a interface das perlas. Deixe o tampão escoar completamente da coluna, até que o fluxo pare, e então feche com um tampão. Encha cuidadosamente a coluna com tampão LUV. Novamente, tenha cuidado ao adicionar o tampão para não perturbar as perlas (Figura 1C).
5. Remova o tampão e colete 6 frações de 1 ml cada. As LUVs normalmente eluem nas frações 3 e 4, sendo identificáveis por uma aparência turva. Após a coleta das frações, lave a coluna com 5 volumes de água e 2 volumes de etanol a 20%. Armazene a coluna a 4 °C (Figura 1C).
6. Armazene as frações a 4 °C, protegidas da luz, até o momento dos testes.

4. Testar as Frações da Coluna

1. As frações da coluna são agora testadas quanto à fluorescência, comparando o tampão LUV com o tampão LUV suplementado com 0,5% de CHAPS. As frações que apresentam aumento na fluorescência devido à presença de CHAPS contêm LUVs. Pipete 100 μl de tampão LUV ou tampão LUV + 0,5% CHAPS em seis poços cada e adicione 5 μl da fração apropriada, misturando bem. Utilize placas de 96 poços opacas, pretas e não tratadas para todos os estudos com LUVs (Figura 1D).
2. Leia a placa a 37 °C com os seguintes parâmetros: comprimento de onda de excitação: 355 nm; comprimento de onda de emissão: 520 nm; ganho (voltagem): 125; posição da óptica: superior; altura de leitura: 5,5 mm. Esta configuração é para o BioTek H1 Synergy utilizando o software Gen 5 2.0 (Figura 1D).
3. As frações 3 e 4 geralmente mostram um aumento de 5 a 10 vezes na fluorescência. Após a análise, combine as frações contendo LUVs e armazene a 4 °C no escuro; aproximadamente 2 ml de lipídio a ~ 2 mM serão purificados (Figura 1D).

5. Estudos da Família BCL-2 Utilizando LUVs

1. Proteínas BCL-2 são testadas quanto à sua capacidade de induzir diretamente a permeabilização de LUVs e quanto à regulação da atividade de permeabilização. Os ensaios com LUVs são normalmente realizados em volumes de 100 μl, a 37 °C, e podem ser analisados em um único ponto temporal após 30 - 60 min (Figuras 2A-C, 3A-B), ou por meio de estudos cinéticos a cada 1 - 2 min durante até 1 h (Figura 2D). Um exemplo de delineamento de ensaio descrevendo componentes, concentrações estoque/finais e ordem de adição é fornecido (Tabela 1). Também é recomendável que o leitor de microplacas agite suavemente a placa antes de cada leitura. Os primeiros minutos frequentemente apresentam leituras esparsas (provavelmente devido a mudanças de temperatura, mistura, etc.), portanto geralmente consideramos os pontos de dados após 2 - 3 leituras em um estudo cinético. Também não é incomum obter barras de erro grandes para algumas das condições, devido à variabilidade entre lotes de LUVs e à eficiência das interações proteicas em concentrações limítrofes de ativação ou inibição.
2. Estoques de proteínas da família BCL-2 devem ser diluídos no tampão de LUVs em uma concentração 100x, e titulações necessárias de BAX, BID e todas as demais proteínas devem ser realizadas para determinar as menores concentrações necessárias para detectar permeabilização mínima de LUVs dependente de BAX na ausência de BID, e sinergia significativa entre BAX e BID. Além disso, todas as demais proteínas requerem titulações para reduzir o desperdício proteico e minimizar as concentrações de adições proteicas subsequentes.

6. Resultados Representativos

Há inúmeras opções para observar e examinar a regulação dependente da família BCL-2 na permeabilização de LUVs. Para gerar um controle positivo de permeabilização de LUV, utilizamos BAX ativado por detergente¹². O detergente, n-octil-β-D-glucosídeo (OG), induz artificialmente a ativação do BAX (para 100 μl de BAX-OG a 2,3 μM: 5 μg de BAX + 0,7% de OG no tampão de LUV, incubar por 60 min a 4 °C, alíquotar e armazenar a -80 °C); portanto, o BAX-OG (10 - 100 nM) pode ser usado como um controle positivo confiável. Vale ressaltar que concentrações de OG abaixo de 0,025% não afetam diretamente a permeabilização de LUV. Um tratamento com CHAPS a 0,5% é utilizado para determinar a quantidade máxima de fluorescência de LUV por ensaio, e esse valor define a marca de 100%. Todos os tratamentos devem ser montados em triplicata. Um exemplo de montagem de ensaio controle com LUV é mostrado na Tabela 1, e os dados correspondentes são apresentados na Figura 2A.

Um ponto inicial necessário para estudar a permeabilização de LUV com proteínas da família BCL-2 é estabelecer as concentrações de BAX e BID que promovem liberação ideal. Como diferentes preparações individuais de proteínas apresentarão atividades de permeabilização de fundo distintas, é aconselhável realizar uma titulação antes de montar análises mais sofisticadas. BAX (50 - 200 nM) e BID (0 - 10 nM) devem ser titulados para obter liberação de fundo mínima e sinergia ideal, conforme mostrado nas Figuras 2B-C, respectivamente. Diversas formas da proteína BID podem ser adquiridas da R&D Systems; alternativamente, o peptídeo do domínio BH3 de BID está disponível na Anaspec. Não existe forma comercial de BAX apropriada para ensaios com LUV, portanto ela deve ser expressa e purificada utilizando métodos publicados^3,13.

Uma vez estabelecidas as concentrações de BAX e BID e sua sinergia, um ensaio comum é determinar a influência de proteínas antiapoptóticas na permeabilização de LUVs dependente de BAX e BID. BCL-xL é um membro antiapoptótico da família BCL-2 disponível comercialmente que, de maneira dose-dependente, inibe a atividade de BAX e BID, geralmente na faixa de excesso molar de 5 a 10 vezes em relação a BAX ou BID (Figura 3A). Esse efeito inibitório pode ser revertido pela adição subsequente de proteínas somente do domínio BH3 (excesso molar de 2 a 5 vezes em relação a BCL-xL) ou peptídeos do domínio BH3 (excesso molar de 5 a 10 vezes em relação a BCL-xL), que se ligam a BCL-xL, permitindo assim que BAX e BID atuem de forma sinérgica e permeabilizem os LUVs (Figura 3B). Na Figura 3B, mostramos o efeito da proteína humana recombinante completa PUMAβ, sendo que o peptídeo do domínio BH3 de PUMA é funcionalmente semelhante (dados não mostrados)⁸. Esse experimento é comumente denominado 'ensaio de desrepressão', pois a proteína PUMA alivia o efeito inibitório de BCL-xL sobre BAX e BID. Idealmente, a adição da proteína/peptídeo somente do domínio BH3 que promove a desrepressão deve ter efeitos mínimos sobre a ativação de BAX¹⁴.

Figura 1. (A) Lipídios solubilizados em clorofórmio são combinados, secos para formar um filme lipídico e tampados. (B) Soluções de ANTS e DPX são preparadas, misturadas e sonicadas para garantir solubilização e homogeneização completas. A solução é adicionada ao filme lipídico, o frasco é selado com parafilm e sonicado por 5 min em banho-maria. A solução agora apresentará aparência leitosa. (C) A solução lipídica sonicada é carregada no miniextrusor, processada 31 vezes e adicionada a uma coluna preparada de Sepharose S-500 para purificação subsequente. (D) As frações obtidas após cromatografia de exclusão por tamanho são analisadas comparando-se as unidades fluorescentes relativas (UFR) no tampão LUV e no tampão LUV + 0,5% CHAPS. A leitura em "tampão LUV" indica fluorescência de fundo com LUVs intactas; a condição "tampão LUV + 0,5% CHAPS" mostrará aumento de fluorescência induzido pela lise, indicativo de LUVs. As frações 3 e 4 geralmente contêm as LUVs e são combinadas após análise. As frações 5 e 6 contêm ANTS não incorporado (ou seja, não dentro das LUVs após extrusão), que apresentam alta fluorescência independente do CHAPS. Clique aqui para visualizar a figura em tamanho maior.

Figura 2. Experimentos de controle da família BCL-2 e titulações de BAX/BID utilizando LUVs. (A) Experimentos de controle. LUVs foram tratados apenas com tampão de LUV, 0,025% de octilglicosídeo "OG", 50 nM de BAX ou 50 nM de OG-BAX. As LUVs foram incubadas por 60 min a 37 °C. A permeabilização (%) é determinada subtraindo-se a fluorescência do tratamento com tampão de todas as amostras; a permeabilização de 100% é determinada por uma amostra solubilizada com CHAPS 0,5%; divide-se os valores experimentais pelo valor do CHAPS para obter a permeabilização percentual de LUV. OG-BAX é o BAX ativado por detergente, que serve como controle positivo confiável para permeabilização de LUV. (B) Determinação da concentração ótima de BAX. LUVs foram tratadas com concentrações crescentes de BAX (50 - 200 nM) na presença de 10 nM de C8-BID "BID" ou apenas tampão. (C) Determinação da concentração ótima de BID. LUVs foram tratadas com concentrações crescentes de BID (0 - 10 nM) na presença de 100 nM de BAX. (D) Um exemplo de conjunto de dados cinéticos de permeabilização de LUV. LUVs foram tratadas com BAX (100 nM) ± BID (10 nM). Leituras foram realizadas a cada dois minutos durante 30 min, com agitação suave da placa por dois segundos antes de cada leitura. As três primeiras leituras (0, 2 e 4 min) não estão incluídas no gráfico. As unidades relativas mínima e máxima de fluorescência (RFU) foram determinadas conforme descrito na seção 4.3. As barras de erro nas Figuras 2A-C representam o desvio padrão de dados triplicados. Os dados na 2D representam um ensaio em duplicata.

Figura 3. Exemplos de interações comuns entre membros da família BCL-2 investigadas utilizando LUVs. (A) A permeabilização de LUVs mediada por BAX e BID é inibida por BCL-xL. LUVs foram incubadas com 100 nM de BAX, 10 nM de BID e concentrações crescentes de BCL-xL (0 – 500 nM). A incubação das LUVs ocorreu por 60 min a 37 °C. (B) PUMA desreprime BCL-xL para promover a função de BAX e BID. LUVs foram incubadas com combinações de 100 nM de BAX, 10 nM de BID, 500 nM de BCL-xL e PUMA (0 – 2,5 μM) por 60 min a 37 °C. PUMA foi usado na concentração de 2,5 μM com BAX isoladamente. As barras de erro representam o desvio padrão de dados triplicados.

Ordem de adição:	1	2	3	4	5	6
CONDIÇÕES	LUV Tampão	OG (0,7%)	BAX (2,3 μM)	OG-BAX (2,3 μM)	CHAPS (10%)	LUVs (2 mM)	TOTAL
Tampão	95 μl					5 μl	100 μl
OG (0,015%)	92,83 μl	2,17 μl				5 μl	100 μl
BAX (50 nM)	92,83 μl	-	2,17 μl			5 μl	100 μl
OG-BAX (50 nM)	92,83 μl			2,17 μl		5 μl	100 μl
CHAPS (0,5%)	90 μl				5 μl	5 μl	100 μl

Tabela 1. Um exemplo de ensaio controle para determinar o efeito do OG-BAX na permeabilização de LUV.

Discussão

O método descrito para gerar LUVs permite uma forma rápida e eficiente de testar a função de várias proteínas da família BCL-2, peptídeos e reagentes relacionados em um ambiente de membrana definido bioquimicamente, semelhante à MMO. Se forem utilizados valores finais para determinar a permeabilização de LUVs, várias placas podem ser montadas para analisar centenas de condições em um único dia. Observamos que os reagentes limitantes nestes ensaios costumam ser a qualidade e a quantidade das proteínas recombinantes; porta...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosph–thanolamine "PE"	Avanti	850725C
L-α-Fosfatidilcolina (Ovo, Galinha) "PC"	Avanti	840051C
L-α-Fosfatidilinositol (Fígado, Bovino) "PI"	Avanti	840042C
L-α-Fosfatidilserina (Cérebro, Suíno) "PS"	Avanti	8400320
Cardiolipina (Coração, Bovino - Sal de Sódio) "CL"	Avanti	840012C
Conjunto mini-extrusor	Avanti	610023
Membrana de PC 0,2 mM	Avanti	610006
Placa Costar preta de 96 poços	Fisher Scientific	07-200-590
BID clivada por caspase-8 humana	R&D Systems	882-B8-050
BCL-xL humano (sem o extremo C)	R&D Systems	894-BX-050
Peptídeos dos domínios BH3 de BID/PUMA	Anaspec	61711/62404
Leitor microplaquetas multifuncional Synergy H1	BioTek	None