Visualizando bactérias em nematóides por microscopia de fluorescência

Resumo

Para estudar o mutualismo entre Xenorhabdus Bactérias e Steinernema Nemátodos, foram desenvolvidos métodos para monitorizar a presença de bactérias e localização no interior de nemátodos. A abordagem experimental, a qual pode ser aplicada a outros sistemas, implica bactérias engenharia para expressar a proteína fluorescente verde e visualização, por meio de bactérias de microscopia de fluorescência dentro do nemátodo transparente.

Resumo

Simbioses, a convivência de dois ou mais organismos, são comuns em todos os reinos da vida. Como dois dos organismos mais ubíquos na Terra, nemátodos e bactérias formam uma grande variedade de associações simbióticas que vão desde benéfico para patogénico ^1-3. Uma associação como é o relacionamento mutuamente benéfico entre as bactérias e nematóides Steinernema Xenorhabdus, que emergiu como um sistema modelo de simbiose ^4. Nematóides entomopatogênicos Steinernema são, usando seu simbionte bacteriano para matar insetos ^5. Para a transmissão entre os hospedeiros de insetos, as bactérias colonizam o intestino do nematóide juvenil fase infecciosa ^6-8. Recentemente, várias outras espécies de nematóides foram mostrados para utilizar as bactérias para matar insectos ^9-13, e começaram investigações examinar as interacções entre os nemátodos e bactérias nestes sistemas <sup> 9.

Descreve-se um método para a visualização de um simbionte bacteriano dentro ou sobre um hospedeiro de nematóides, tirando partido da transparência óptica de nemátodos, quando vistas através de microscopia. As bactérias são manipuladas para expressar uma proteína fluorescente, permitindo a sua visualização por microscopia de fluorescência. Estão disponíveis muitos plasmídeos que transportam genes que codificam proteínas que fluorescem a diferentes comprimentos de onda (ou seja, verde ou vermelha), e de conjugação de plasmídeos a partir de uma estirpe de Escherichia coli doador em um receptor symbiont bacteriana é bem sucedida para uma ampla gama de bactérias. Os métodos descritos foram desenvolvidos para investigar a associação entre Steinernema carpocapsae e nematophila Xenorhabdus ^14. Métodos semelhantes têm sido utilizados para investigar outros nematóides bactéria associações de ^{9, 15-18} e, portanto, o método é geralmente aplicável.

O Method permite a caracterização da presença de bactérias e de localização dentro de nemátodos em diferentes fases de desenvolvimento, proporcionando insights sobre a natureza da associação e do processo de colonização ^{14, 16, 19.} A análise microscópica revela tanto a frequência dentro de uma população de colonização e localização de bactérias aos tecidos do hospedeiro ^{14, 16, 19-21.} Esta é uma vantagem sobre os outros métodos de monitorização de bactérias dentro das populações de nematóides, tais como a sonicação ou a trituração ^{22 23,} o qual pode fornecer níveis médios de colonização, mas não pode, por exemplo, discriminar populações com uma alta frequência de baixa carga simbióticas de populações com uma baixa freqüência de cargas simbióticas elevados. Discriminando a freqüência ea carga de bactérias colonizadoras pode ser especialmente importante quando a seleção ou caracterização de bactérias mutantes para os fenótipos de colonização ^{21, 24.} Com efeito, a microscopia de fluorescência tem sido utilizada na pesquisa de alto rendimento de mutantes bacterianos para defeitos de colonização ^{17, 18,} ​​e é menos trabalhosa do que outros métodos, incluindo a sonicação ^{22, 25-27} e dissecção de nemátodos individuais ^{28, 29.}

Protocolo

1. Construção de uma estirpe bacteriana fluorescente via Conjugação

1. Crescer a estirpe receptora (symbiont a ser examinada), e estirpe dadora durante a noite. A estirpe dadora, Escherichia coli, geralmente, deve ser capaz de doar DNA através de conjugação e deve ser transformada com uma. Plasmídeo (Tabela 2), que transporta um gene que codifica uma proteína fluorescente Dependendo do plasmídeo, de uma estirpe ajudante de conjugação também podem ser necessários. Se for assim, esta estirpe deve também ser cultivadas durante a noite. A estirpe dadora e tensão auxiliar devem ser cultivadas com antibióticos para seleccionar para a manut....

Discussão

O protocolo aqui descrito proporciona um método para a detecção óptica de bactérias dentro de um hospedeiro de nemátodos (Figura 1). Este método tira vantagem da transparência óptica dos nemátodos e a capacidade de bactérias fluorescentes de etiquetas, permitindo a análise in vivo das bactérias dentro do hospedeiro nematóide (Figura 3). Especificamente, esta abordagem identifica a localização de bactérias dentro de seu hospedeiro. Ao contar uma população de nemátodos e.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Agar lipídico (Estéril)			8 gramas de caldo nutriente, 15 gramas de agar de extracto de levedura, 5 gramas de água, 890 ml, 10 ml 0,2 g / ml de MgCl2. 6H 2 0, 96 ml de solução de xarope de milho *, 4 ml de óleo de milho * Mexa mídia ao derramar placas * Adicionar ingrediente estéril após a autoclavagem
Solução Xarope de milho (Estéril)			7 ml de xarope de milho, 89 ml de água mistura e autoclave
Solução ovo			16,6 ml de hipoclorito de sódio a 12%, 5 ml de KOH 5M, 80 ml de água
Lisogenia Caldo (Estéril)			5 gramas de extrato de levedura, triptona 10 gramas, 5 gramas de sal, 1 L de água mistura e autoclave
Microcentrifugue	Pescador	13-100-675	Qualquer microcentrífuga que contém tubos de microcentrífuga funcionará
Centrifugador	Beckman	366802	Centrífuga de topo grande tabela que contém 15 ml e 50 ml, tubos cónicos
Estéril 60 mm x 15 milímetros prato de Petri	Pescador	0875713
50 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-539-6
15 ml tubos de centrífuga	Pescador	05-531-6
Estéril 100 mm x 20 milímetros prato de Petri	Pescador	0875711Z	Mais profundo do padrão pratos de Petri
Placa de 24 poços	Greiner Bio-One	662000-06
Microscópio			O microscópio fluorescente necessita de capacidades compatíveis com o fluoróforo
Paraformaldeído	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS (Estéril)			8 g de NaCl 0,2 g de KCL 1,44 g de Na 2 HPO 4 0,24 g de KH 2 PO 4 1 L de água Ajustar a um pH de 7,4 e 1 L de água a autoclave e
Tubos de microcentrífuga	Pescador	05-408-138	2 ml ou 1,5 ml tubos
Sacudidor			Qualquer agitador que faz com que o líquido se mova suavemente vai trabalhar
Ácido Diaminopimélico	Sigma	D-1377	Se for necessário, meios de comunicação para completar uma concentração de 1 mM ou