Descrito aqui é um In vivo A técnica de sub-imagem estruturas celulares em animais expostos a anoxia usando um fluxo de gás através da câmara microincubation em conjunto com um microscópio confocal de disco giratório. Este método é simples e suficientemente flexível para satisfazer uma variedade de parâmetros experimentais e sistemas modelo.
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Artigo de método
Uso de Microscopia Time Lapse para Visualize Anoxia induzida Suspended Animation em
Neste artigo
Resumo
Resumo
Caenorhabdits elegans tem sido amplamente utilizado no estudo da resistência a fadiga, o que é facilitado pela transparência das fases adultas e de embriões, assim como pela disponibilidade de mutantes genéticos e estirpes transgénicas que expressam uma variedade de proteínas de fusão 1-4. Além disso, os processos dinâmicos, tais como a divisão celular pode ser visualizado utilizando proteínas repórter fluorescente etiquetado. O estudo da mitose pode ser facilitado através da utilização de experiências de lapso de tempo de vários sistemas, incluindo organismos intactos, assim a C. precoce embrião elegans é bem adequado para este estudo. Apresentado aqui é uma técnica pela qual imagem in vivo de sub-estruturas celulares em resposta a anóxica (99,999% N 2; <2 ppm O 2) o estresse é possível através de um fluxo de gás através de simples instalação em um microscópio de alta potência. A câmara microincubation é usado em conjunto com um fluxo de azoto e de gás através de um microscópio confocal de disco giratóriopara criar um ambiente controlado no qual os animais podem ser visualizados in vivo. Usando GFP-tagged tubulina gama e histona, a dinâmica ea prisão de divisão celular podem ser monitorados antes, durante e após a exposição a um ambiente privado de oxigênio. Os resultados desta técnica são de alta resolução, vídeos e imagens detalhadas das estruturas celulares dentro blastômeros de embriões expostos à privação de oxigênio.
Protocolo
1. Preparação da Amostra
- Produzir ou obter apropriado transgênico C. elegans estirpe de interesse, utilizando metodologias de transgênicos ou de Caenorhabditis Genética da Center (CGC) ou colega. Neste caso estamos usando tensão TH32 (torta-1 :: TBG-1 :: GFP; torta-1 :: GFP :: H2B) 5 para visualizar cromossomos e centrossomas como marcadores para a divisão celular.
- Gerar uma população sincronizada usando um dos três métodos: 1) se desintegrar adultos grávidas em solução de hipoclorito e usar embriões restantes 6, 2) escolher adultos grávidas em uma placa sem sementes e deixá-los colocar embriões pa....
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Resultados
Embriões C. elegans expostas à privação de oxigênio grave (anoxia) são capazes de sobreviver com a prisão de processos biológicos, incluindo desenvolvimento e divisão celular 7. A prisão anóxia induzida da divisão celular pode ser monitorizada, a um nível sub-celular, por meio de uma câmara de microincubation em conjunto com um fluxo de azoto e de gás através de um microscópio confocal de disco giratório para criar um ambiente controlado no qual os animais podem ser visualizados in vivo
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Discussão
Privação de oxigênio e Suspended Animation
Embora a exposição à privação de oxigênio grave pode ser fatal para alguns organismos, alguns organismos são capazes de sobreviver à exposição a anoxia. No caso de C. elegans, a sobrevivência de exposição anoxia depende estágio de desenvolvimento e de resposta à anoxia é a entrada para um estado de animação suspensa reversível no qual um certo número de processos biológicos observáveis são presos. Processos de divisão celular, o desenvolvime.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de expressar o nosso apreço pela entrada e comentários dos membros do Laboratório de Padilla. Cepas de nematóides neste trabalho foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis, que é financiado pelo NIH National Center for Research Resources (NCRR). Nós reconhecer e agradecer o Dr. Lon Turnbull de assistência técnica com a microscopia confocal. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (NSF-IOS, carreira) para PAP
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes / Equipamentos | Composição | ||
| Solução de hipoclorito | 0,7 g de KOH, 12 ml de NaOCl a 5%, levar a 50 ml com DDQ 2 0 | ||
| Tampão M9 | 3 g KH 2 PO 4, 11 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml (1 M) MgSO 4 por 1 L DDH 2 O | ||
| Lâminas de vidro de microscópio | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3 "x1" mm X1.0 |
| Rodada micro lamínula | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm de diâmetro |
| Halocarbon óleo 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anestésico | Tric 0,5%aine, tetramisole 0,05% | ||
| Leiden Perfusão Fechado Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| Nitrogênio UHP | Calgaz (Air Liquide) | > 99,9990% N 2 <2 ppm de O2 | |
| Tubos de plástico | VWR | 89068-468 | 0.062 "ID x 0,125" OD |
| Spinning microscópio confocal de disco | McBain Sistemas | Invertido Zeiss microscópio óptico, o sistema de iluminação de epifluorescência, CSU-10 Yokogawa digitalizador confocal, Hamamatsu multiplicador de electrões de câmara CCD. |
Referências
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11<....
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Reimpressões e permissões
