RNA-seq Análise de transcriptomas de trombina-tratados e controle humano pulmonar células endoteliais microvasculares

Summary

Este protocolo apresenta um procedimento completa e detalhada para aplicar RNA-seq, uma tecnologia de DNA poderoso próxima geração de sequenciação, de transcriptomas de perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares, com ou sem tratamento com trombina. Este protocolo é generalizável a várias células ou tecidos afetados por reagentes ou estados diferentes doenças.

Abstract

A caracterização da expressão do gene em células por meio de medição de níveis de mRNA é uma ferramenta útil na determinação de como a maquinaria transcricional da célula é afectada por sinais externos (por exemplo, tratamento com drogas), ou como células diferem entre um estado saudável e de um estado de doença. Com o advento e aperfeiçoamento contínuo da próxima geração de tecnologias de sequenciação de DNA, RNA-sequenciação (RNA-seq) tornou-se um método cada vez mais popular de análise do transcriptoma para catalogar todas as espécies de transcritos, para determinar a estrutura da transcrição de todos os genes expressos e quantificar os níveis de expressão de mudar o conjunto total de transcritos de ^1,2 um tecido, célula ou organismo determinado. RNA-seq está a substituir gradualmente microarranjos de DNA como um método preferido para a análise do transcriptoma porque tem as vantagens de um perfil transcriptoma completa, proporcionando um dado tipo digital (número de cópias de qualquer transcrição) e não se basear em qualquer sequen genómico conhecidoce ^3.

Aqui, apresentamos um protocolo completo e detalhado para aplicar RNA-seq para transcriptomas perfil em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com ou sem tratamento de trombina. Este protocolo é baseado em nosso estudo recente publicado intitulado "RNA-seq revela Transcriptoma Novel de genes e suas isoformas em humanos pulmonares células endoteliais microvasculares Tratados com trombina," ⁴ em que realizaram com sucesso a primeira análise completa do transcriptoma humano pulmonares células endoteliais microvasculares tratado com trombina usando RNA-seq. Ele rendeu recursos sem precedentes para a experimentação ainda mais para obter insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes trombina mediada disfunção endotelial na patogênese de doenças inflamatórias, câncer, diabetes e doença cardíaca coronária, e fornece novas pistas para potenciais alvos terapêuticos para essas doenças.

O texto descritivo deste protocoloé dividido em quatro partes. A primeira parte descreve o tratamento de humanos pulmonares células endoteliais microvasculares com trombina e isolamento de ARN, análise de qualidade e de quantificação. A segunda parte descreve a construção da biblioteca e seqüenciamento. A terceira parte descreve a análise de dados. A quarta parte descreve um ensaio de RT-PCR de validação. Os resultados representativos de vários passos-chave são exibidos. Dicas úteis ou precauções para impulsionar o sucesso em passos-chave são fornecidos na seção de Discussão. Embora este protocolo utiliza humanas pulmonares células endoteliais microvasculares tratados com trombina, pode ser generalizado para transcriptomas perfil em ambas as células de mamíferos e não mamíferos e dos tecidos tratados com diferentes estímulos ou inibidores, ou para comparar transcriptomas em células ou tecidos entre um estado saudável e um estado de doença.

Protocol

Um fluxograma descrevendo este protocolo é mostrado na Figura 1.

1. O tratamento de células com trombina, RNA Isolation, Quality Assessment e Quantificação de RNA

1. Cultura As células endoteliais microvasculares de pulmão humano (HMVEC-LBL) a 90-100% de confluência em placas de 6 poços em meio EGM-2 com 5% de FBS, factores de crescimento e antibióticos (Lonza, cat # CC-3202).
2. Alterar media para os meios de comunicação de fome (0% de FBS) 30 min antes do tratamento com trombina.
3. Tratar as células com 0,05 U / ml de trombina ou deixar sem tratamento como um controlo durante 6 horas a 37 ° C e....

Results

Para o Passo 1: O 28s: 18s razão é tradicionalmente utilizada como um indicador da degradação de ARN. Idealmente, o pico 28s deverá ter aproximadamente duas vezes a área da banda de 18s (uma proporção de 2), no entanto este rácio ideal não é muitas vezes visto na prática. Além disso, 28s: 18s rácios obtidos a partir de métodos espectrofotométricos pode subestimar a quantidade de degradação do RNA. Para quantificar mais precisamente a degradação, e, por conseguinte, a qualidade da amostra de RNA, o siste.......

Discussion

As principais etapas

Manipulação de RNA: RNases irá degradar ainda os mais elevada qualidade de ARN, por isso deve ser tomado cuidado durante o isolamento, o armazenamento e utilização de RNA ^10. Luvas são sempre usadas para evitar a contaminação por RNases encontrados em mãos humanas. As luvas devem ser mudados frequentemente, especialmente depois de tocar a pele, maçanetas ou outras superfícies comuns. Um conjunto de pipetas deve ser dedicado exclusivamente para o .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentes ou Equipamentos	Companhia	Número de catálogo	Comentários
As células endoteliais microvasculares de pulmão humano	Lonza	CC-2815
Lonza, Kit Bala	Lonza	CC-3202	Contém EGM-2, FBS, factores de crescimento e antibióticos
Trombina	Sigma	T4393
Ambion mir Vana Kit	Life Technologies	AM 1560
RNase-Zap	Life Technologies	AM9782
Experion StdSens RNA	Bio-Rad	700-7103
TruSeq RNA PreparaçãoConjunto	Illumina	FC-122-1001
Contas AMPureXP	Beckman Coulter	A63881
Sobrescrito transcriptase reversa II	Life Technologies	18064-014
Experion 1K DNA	Bio-Rad	700-7107
QuantiTect SyberGreen	Qiagen	204163
PE Cluster Geração Kit	Illumina	PE-401-3001
PhiX Controle Kit	Illumina	FC110-301
200 Ciclo SBS Kit	Illumina	FC-401-3001
HiScanSQ *	Illumina	SY-103-2001
CBOT	Illumina	SY-301-2002
qPCR máquina - Viia7	Life Technologies	Equipamento Model # VIIA7 / # 10631261	Ou equivalente
Experion Sistema	Bio Rad	7007001	Bioanalyzer é um sistema alternativo
Espectrofotômetro	Bio-Tek	Epoch Microplaca Espectrofotômetro	Ou equivalente
Centrífuga - Sorvall Legend XTR	Thermo Scientific	75004521	Ou equivalente
Suporte magnético	Life Technologies	AM10027
96 poços termociclador	Geral Fornecedor Lab
			Lista Tabela 3. Dos Reagentes chave e Mi Maiorquipment. *, No vídeo, em vez de HiSeq1000 HiScanSQ foi demonstrada.