Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Resumo

Um método quantitativo para a análise da replicação do cromossoma de temporização é descrito. O método utiliza a incorporação de BrdU, em combinação com fluorescente In situ Hibridização (FISH) para avaliar a temporização da replicação dos cromossomas de mamíferos. Esta técnica permite a comparação direta dos cromossomos reorganizados e não-reorganizadas dentro da mesma célula.

Resumo

A replicação do ADN de mamíferos inicia em múltiplos locais ao longo de cromossomas, em momentos diferentes durante a fase S, na sequência de um programa de replicação temporal. A especificação do tempo de replicação é pensado para ser um processo dinâmico, regulado por sinais específicos de tecido e de desenvolvimento, que são sensíveis às modificações epigenéticas. No entanto, os mecanismos de regulação, onde e quando inicia a replicação de ADN ao longo de cromossomas permanece pouco compreendido. Cromossomos homólogos geralmente replicar de forma síncrona, no entanto, existem notáveis ​​exceções a esta regra. Por exemplo, em células de mamíferos do sexo feminino de um dos dois cromossomas X torna-se tarde replicação através de um processo conhecido como X inactivação ^1. Juntamente com este atraso no tempo de replicação, estimada em 2-3 horas, a maioria dos genes silenciados transcricionalmente em tornar-se um cromossoma X. Além disso, um locus de cis-acting discreta, conhecida como o centro de inactivação X, regula este processo de inactivação X, incluindo thindução e do tempo de replicação atraso no cromossomo X inteiro inativo. Além disso, os rearranjos certas encontrados em células cancerosas e em células expostas à radiação ionizante exibir um atraso significativo no tempo de replicação de> 3 horas que afeta o cromossoma inteiro ^2,3. Um trabalho recente de nosso laboratório indicam que a ruptura do discreto cis-acting resultado loci autossômica em um fenótipo extremamente tarde replicante que afeta o cromossomo ⁴ inteiro. Estudos adicionais "engenharia cromossomo 'indicam que os rearranjos cromossômicos determinados que afetam muitos cromossomos resultado diferente neste fenótipo replicação timing anormal, sugerindo que todos os cromossomos de mamíferos contêm discretos cis-agindo loci que controlam a replicação de tempo adequado de cromossomos individuais ^5.

Aqui, nós apresentamos um método para a análise quantitativa de temporização replicação cromossoma combinada com hibridação in situ fluorescente. Estemétodo permite uma comparação directa de temporização replicação entre cromossomas homólogos dentro da mesma célula, e foi adaptada a partir de ^6. Além disso, este método permite a identificação inequívoca dos rearranjos cromossómicos que se correlacionam com alterações no tempo que afectam a replicação do cromossoma inteiro. Este método apresenta vantagens em relação recentemente desenvolvido elevado rendimento matriz de micro-sequenciação ou os protocolos que não pode distinguir entre homólogos alelos presentes no rearranjados e un-rearranjado cromossomas. Além disso, porque o método descrito aqui, avalia células individuais, que podem detectar alterações na temporização cromossoma replicação em rearranjos cromossómicos que estão presentes em apenas uma fracção das células de uma população.

Protocolo

1. BrdU Incorporação (Rotulagem Terminal)

1. Células da placa para cerca de 70% de confluência, em cultura de tecido 150 milímetro hr prato 24 antes da adição de BrdU.
2. Substitua com meios frescos meio completo contendo 20 ng / ml de BrdU (Sigma) em pontos de tempo apropriados antes da colheita. A duração do tempo de células são cultivadas em meios com BrdU irá variar com o tipo de células e espécies, normalmente a fase G2 dura entre 2 e 5 horas (Figura 1).

2. Colheita cromossomo das Culturas monocamada de células

1. Remover os meios de cultura a partir da placa e recolher 10 ml num tubo de ....

Resultados

Um exemplo da análise de tempo de replicação para cromossoma 6 humano é mostrada na Figura 2. As células que contêm uma deleção do gene ASAR6 ^4, localizada em 6q16.1, foram expostas a BrdU durante 5 horas, colhidas para células mitóticas e processados ​​por FISH com sonda de tinta cromossoma 6 (Vysis) e para a incorporação de BrdU. Note-se que há uma diferença significativa no padrão de BrdU bandas entre os dois 6, o que é consistente com um atraso no tempo de replicação de> 2 horas para u.......

Discussão

A preparação dos spreads cromossoma é um passo crítico para o ensaio de replicação de temporização-sucedido descrito aqui. A inclusão de um passo de pré-tratamento antes da colcemida tratamento hipotónico pode auxiliar na frequência e propagação de células em mitose. Nós normalmente expor as células a colcemdi durante 1-3 horas antes da colheita, e usar colcemida, a uma concentração final de 10 ug / ml. No entanto, a inclusão de um passo de pré-tratamento colcemida podem alterar o comprimento de G2 e consequentemente, p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de Catálogo	Comentários (opcional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 ug / ul
Nick Tradução Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Espectro laranja dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varia
LSI / WCP tampão de hibridação	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP tampão de hibridação	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Cromossomo paints	MetaSystems Grupo	D-14NN-050-TR
Microscópio Olympus BX61 Fluorescente	Olimpo	BX61TRF-1-5
Microscópio sistema de software de imagem	Aplicada imagem	Cytovision 3.93.1
Câmera Digital	Olimpo	UCMAD3
			Em receitas de hibridação in situ Soluções formamida 70% Formamide/2x SSC 35 ml formamida * (Sigma) 10 ml SSC 10x 5 ml d 2 H 2 0 pH a 7,0 com HCl (Sigma) * É importante a utilização de formamida que foi armazenado a -20 ° C. Temperatura de armazenamento prolongado sala vai gerar ácido fórmico e do pH wmal estar muito baixa. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamida (Sigma) 10 ml SSC 10x 15 ml de dH2O pH a 7,0 com HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) 358 g Citrato de sódio (Sigma) dH 2 O para o volume PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Fazer uma solução 0,1 M de cada de fosfato de sódio (Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 500 ml). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O para o volume 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O para volume. PN: Ajustar o pH de 0,1 M de Na 2 HP0 4 a pH 8,0 com 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtrar esterilizar e adicionar 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g de leite seco não gordo (Sigma) 25 ml de tampão PN (receita acima) Mistura-se durante 15-20 minutos com agitação constante. 2 vezes girar a 400 xg durante 10 min. Use sobrenadante, e certifique-se de não perturbar as proteínas do leite precipitados.