Um método quantitativo para a análise da replicação do cromossoma de temporização é descrito. O método utiliza a incorporação de BrdU, em combinação com fluorescente In situ Hibridização (FISH) para avaliar a temporização da replicação dos cromossomas de mamíferos. Esta técnica permite a comparação direta dos cromossomos reorganizados e não-reorganizadas dentro da mesma célula.
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Artigo de método
Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente
Neste artigo
Resumo
Resumo
A replicação do ADN de mamíferos inicia em múltiplos locais ao longo de cromossomas, em momentos diferentes durante a fase S, na sequência de um programa de replicação temporal. A especificação do tempo de replicação é pensado para ser um processo dinâmico, regulado por sinais específicos de tecido e de desenvolvimento, que são sensíveis às modificações epigenéticas. No entanto, os mecanismos de regulação, onde e quando inicia a replicação de ADN ao longo de cromossomas permanece pouco compreendido. Cromossomos homólogos geralmente replicar de forma síncrona, no entanto, existem notáveis exceções a esta regra. Por exemplo, em células de mamíferos do sexo feminino de um dos dois cromossomas X torna-se tarde replicação através de um processo conhecido como X inactivação 1. Juntamente com este atraso no tempo de replicação, estimada em 2-3 horas, a maioria dos genes silenciados transcricionalmente em tornar-se um cromossoma X. Além disso, um locus de cis-acting discreta, conhecida como o centro de inactivação X, regula este processo de inactivação X, incluindo thindução e do tempo de replicação atraso no cromossomo X inteiro inativo. Além disso, os rearranjos certas encontrados em células cancerosas e em células expostas à radiação ionizante exibir um atraso significativo no tempo de replicação de> 3 horas que afeta o cromossoma inteiro 2,3. Um trabalho recente de nosso laboratório indicam que a ruptura do discreto cis-acting resultado loci autossômica em um fenótipo extremamente tarde replicante que afeta o cromossomo 4 inteiro. Estudos adicionais "engenharia cromossomo 'indicam que os rearranjos cromossômicos determinados que afetam muitos cromossomos resultado diferente neste fenótipo replicação timing anormal, sugerindo que todos os cromossomos de mamíferos contêm discretos cis-agindo loci que controlam a replicação de tempo adequado de cromossomos individuais 5.
Aqui, nós apresentamos um método para a análise quantitativa de temporização replicação cromossoma combinada com hibridação in situ fluorescente. Estemétodo permite uma comparação directa de temporização replicação entre cromossomas homólogos dentro da mesma célula, e foi adaptada a partir de 6. Além disso, este método permite a identificação inequívoca dos rearranjos cromossómicos que se correlacionam com alterações no tempo que afectam a replicação do cromossoma inteiro. Este método apresenta vantagens em relação recentemente desenvolvido elevado rendimento matriz de micro-sequenciação ou os protocolos que não pode distinguir entre homólogos alelos presentes no rearranjados e un-rearranjado cromossomas. Além disso, porque o método descrito aqui, avalia células individuais, que podem detectar alterações na temporização cromossoma replicação em rearranjos cromossómicos que estão presentes em apenas uma fracção das células de uma população.
Protocolo
1. BrdU Incorporação (Rotulagem Terminal)
- Células da placa para cerca de 70% de confluência, em cultura de tecido 150 milímetro hr prato 24 antes da adição de BrdU.
- Substitua com meios frescos meio completo contendo 20 ng / ml de BrdU (Sigma) em pontos de tempo apropriados antes da colheita. A duração do tempo de células são cultivadas em meios com BrdU irá variar com o tipo de células e espécies, normalmente a fase G2 dura entre 2 e 5 horas (Figura 1).
2. Colheita cromossomo das Culturas monocamada de células
- Remover os meios de cultura a partir da placa e recolher 10 ml num tubo de centrífuga de 15 ml. Descarte de mídia restantes.
- Enxaguar as células uma vez com 10 ml Versine [ou HBSS (Sigma)].
- Adicionar 5 ml de tripsina a 0,25% em Versine (ou HBSS) para o prato. Incubar à temperatura ambiente até que as células são separadas da placa.
- Adicionar a suspensão de células tripsinizadas para o tubo contendo os 10 ml de meios de comunicação a partir do passo 2.1.
- Centrifugar a 400 xg durante 10 min para sedimentar as células. Aspirar o sobrenadante, deixando 0,5 ml de meio mais o sedimento de células.
- Ressuspender as células pipetando cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur.
- Adicionar 3 gotas de uma solução hipotónica de KCl (0,075 M (Sigma), aquecido a 37 ° C); misturar a suspensão de células com uma pipeta de Pasteur. Adicionar 0,5 ml de solução hipotónica e misturar novamente com uma pipeta de Pasteur. Levar o volume de solução hipotónica de 5 ml e misturar novamente. Incubar a 37 ° C durante 20-45 min, dependendo do tipo de célula.
- Centrifugar a 400 xg durante 10 min. Aspirar o sobrenadante, deixando 0,5 ml de meio mais o sedimento de células.
- Ressuspender o sedimento de células suavemente sacudindo o tubo. As células osmoticamente inchados será frágil neste momento, por isso o cuidado deve ser tomado para não atrapalhar as membranas citoplasmáticas.
- Adicione 3 gotas de fixador Carnoy (ácido acético glacial 01:03: O metanol) e misturar delicadamente com uma pipeta pipeta Pasteure. Adicionar 0,5 ml de fixador e misture com cuidado pipetando com uma pipeta Pasteur. Levar o volume de fixador para 5 ml e misturar outra vez suavemente por pipetagem com pipeta de Pasteur. As células fixadas podem ser armazenadas no escuro a -20 ° C durante vários meses.
- Centrifugar e aspirar como no passo 2.8.
- Ressuspender o sedimento de células em fixador fresco; estimar o volume do sedimento e add ~ 10x o volume de fixador de Carnoy.
- Adicionar a suspensão de células gota a gota, no molhado, as lâminas de microscópio geladas; segurar a corrediça a um ângulo de ~ 45 ° e permite que a suspensão de células a fluir sobre a superfície da lâmina. Coloque a lâmina plana sobre toalhas de papel e inundar o slide com fixador e deixar secar ao ar. Verificar as lâminas para a presença de mitose espalha utilizando um microscópio invertido.
3. RNase tratamento e desidratação do etanol
- Ul local 200, de 10 ug / ml RNase A (Sigma) em 2x SSC para cada lâmina, e incubar a 37 deg; C durante 1 h.
- Lavar as lâminas três vezes com 2x SSC, pH 7,0 à temperatura ambiente durante 3 min cada.
- Desidratar as lâminas por meio de uma série de EtOH (Sigma) (70%, 90% e 100%) à temperatura ambiente durante 3 min cada.
- Secar as lâminas de ar, à temperatura ambiente.
4. Preparação de coquetéis Sonda para BAC Além disso cromossomo específico centrómero Enumeração Probe (CEP) ou para Tintas cromossoma inteiro de hibridização in situ
- Para a hibridização BAC / CEP simultânea, preparar dois coquetéis sonda separados para pré-hibridização. Nós descobrimos que a pré-hibridação das sondas BAC e CEP separadamente com resultados diferentes stringencies em menos fundo e intensidades mais elevadas de sinal. Verificámos também que Fosmids individuais também pode ser usado no lugar de clones BAC. A formulação cocktail descrito abaixo representa os volumes para um único slide. Se o processamento vários slides usando as mesmas sondas simplesmente aumentar o volume adequado do iately.
* BAC DNA cocktail sonda:
11,5 ul de tampão de hibridação (formamida a 50% (Sigma) / 2x SSC Sulfate / dextrano (Sigma)) 2 uL de dH2O
2,5 DNA BAC/Cot1 ul em dH2O (veja abaixo a rotulagem protocolo) 15 do volume total de ul
* CEP cocktail sonda:
7 ul de tampão de hibridação CEP (65% Sulfato Formamide/2x SSC / Dextran) 2 uL de dH2O
1 uL de ADN CEP/Cot1 (adquirido prelabeled com Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 ul de volume total de
* Depois de desnaturação e hibridização pré-(passo 5.1) mix BAC sonda com CEP sonda em uma relação de 25 03:02 cocktails sonda uL / slide e misture.
OU
- Aliquota de 20 ul / lâmina de sonda Whole Chromosome Paint (Cy3/Texas vermelho) em um tubo. Proceder à desnaturação e hibridação pré-passo.
- Desnaturar cocktail sonda (s) a 75 ° C durante 10 min. Pré-hibridação a 37 ° C durante 30 minutos para permitir que o DNA Cot1 para hibridar com sequências repetitivas e para evitar a hibridação subsequente à metafase cromossomas.
- Lâminas desnaturam em frascos Coplin em 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 a 72 ° C durante 3 min.
- Imediatamente desidratar as lâminas por meio de uma série de EtOH (70%, 90% e 100%), em frascos Coplin a 4 ° C durante 3 min cada.
- Permitir que as lâminas para o ar seco à temperatura ambiente.
- Pré-aquecer as lâminas a 45 ° C mais quente na corrediça para a última 10 min da sonda de pré-hibridação (passo 5.1). Misture cocktails pré-hibridizados sonda se necessário e adicionar 25 ul a cada slide, coloque delicadamente uma lamela em cada slide e vedação ao longo de todas as bordas com cimento de borracha. Incubar durante a noite a 37 ° C numa câmara húmida para evitar a evaporação.
6. Hibridização pós Lava
- Lavagem das lâminas em frascos Coplin 3 vezes em 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 a 38-40 ° C durante 3 min cada. A temperatura das lavagens pode variar entre as sondas. Se houver a hibridação de fundo elevado é possível aumentar a temperatura das lavagens. Por outro lado, se o sinal for fraco e não há nenhum fundo em seguida, é possível diminuir a temperatura dessas lavagens.
- Wash desliza uma vez em tampão PN à temperatura ambiente por 3 min, e avançar para a etapa de detecção BrdU.
7. BrdU Detecção
- Bloco desliza com tampão PNM durante 10 minutos (200 ^ l / lâmina), à temperatura ambiente, no escuro.
- Escorra lâminas girando na borda em uma toalha de papel. Adicionar 100 ul de anti-BrdU-FITC (50 ug / ml ou Millipore Roche) em tampão PNM durante 30 min a 37 ° C.
- Lavar as lâminas três vezes em tampão PN à temperatura ambiente durante 3 min cada.
- Drenartampão PN em excesso desliza um de cada vez, ligando aresta sobre uma toalha de papel. Adicionar 20 ul de DAPI / Antifade solução de montagem (Invitrogen). Cobrir a lâmina com uma toalha de papel e pressione a lamela para forçar a saída de bolhas de ar e solução de montagem em excesso. Proceder à análise de imagem.
8. Captura de Imagens e quantificar incorporação de BrdU
- As imagens são capturadas com uma Olympus BX61 microscópio de fluorescência e CCD da câmera Olympus, 100x objetivo, roda de filtros-automática e software Cytovision (Applied Imaging). BrdU é capturado utilizando um filtro FITC; tintas cromossômicas (Texas Red, MetaSystems ou Cytocell), BAC (Cy3) e CEP (Vysis Spectrum Orange) sondas são captadas com uma Red Texas ou Cy3 filtro; DAPI é capturado com um filtro de DAPI (ver As Figuras 2 e 3).
- Cromossomas individuais de interesse são identificadas com BAC / CEP ou sondas específicas para o cromossoma de pintura (Figuras 2B e 3B). Utilizandoo software Cytovision, cada cromossoma de interesse é "cut-out" a partir da propagação da metafase, como um todo, uma linha é desenhada através do ao longo do comprimento do cromossoma do braço curto a longo braço (Figuras 2C e 3C). O software Cytovision é usado para quantificar o perfil de intensidade de pixel ao longo do comprimento de cada cromossoma. O software Cytovision calcula a área ocupada pelos pixels e quantifica a intensidade dos pixels representados pelos sinais de BrdU ou DAPI em cada cromossoma isolado. A intensidade de pixel média representada por cada cromossoma é então multiplicado por a área ocupada pelos pixels para se obter o número total de pixels (Tabela 1 e Figura 4). Além disso, este protocolo permite a visualização das últimas regiões replicação dos cromossomas. Por conseguinte, o padrão de bandas de incorporação de BrdU permite a detecção das regiões activamente replicantes de cromossomas, e as diferenças em temporização entre a replicação cromospares ome são vistas como diferenças neste padrão de bandas (Figuras 2 e 3). Finalmente, estas diferenças nos padrões de ligação podem ser comparados com os mapas de replicação conhecidos de tempo para cada cromossoma 6,7, o que permite uma estimativa da diferença de tempo entre a replicação cromossomas homólogos ou braços cromossoma 4. Por exemplo, o cromossoma dois 6 está na Figura 3A exibir uma diferença no padrão de bandas de> 2 horas quando comparado com o tempo normal de replicação do cromossoma 6 4.
Além disso, um procedimento semelhante ao descrito aqui foi usada com sucesso para o estudo do tempo de replicação assíncrona entre os cromossomas X e inactivos activo 8,9. Os cromossomos X ativos e inativos foram identificados utilizando tintas cromossomo X. As imagens foram adquiridas utilizando Quips mFISH software (Vysis) e o número de pixels ocupados pelos cromossomas X e o número de pixels ocupados por fluorescência laBeled BrdU foram então calculados utilizando NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).
9. Nick Tradução de alcoolemia de DNA para marcação fluorescente (Vysis)
- Adicionar a mistura de sonda que se segue para um tubo de microcentrífuga refrigerada:
70 ul (4 ug de ADN) em dH2O
10 jul 0,2 mM dUTP-laranja ou verde
20 ul 0,1 mM dTTP
20 Buffer de Tradução ul 10x Nick
40 ul NT dNTP (menos dTTP)
40 enzima Tradução ul nick
Volume de 200 ul totais
Incubar @ 16 ° CO / N. Pare reacção por aquecimento a 70 ° C durante 10 min. Refrigerar em gelo durante 5 min. - Precipitar o ADN com etanol, adicionando a seguir para a mistura de sonda:
200 ul de solução de sonda
48 ul de NaOAc 3 M
160 Cot1DNA ul (0,25 ug / ul)
1200 uL de EtOH a 100% - Armazenar a -80 ° C durante 10 min a O / N.
- Gire in frio a 12000 xg durante 20 min. Decantar EtOH. Lavar uma vez com EtOH a 70%. Girar como antes. Decantar EtOH. Ar seco apenas até evapora EtOH. Ressuspender em 40 uL de dH2O para a concentração final de 100 ng / ul de DNA de BAC.
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Resultados
Um exemplo da análise de tempo de replicação para cromossoma 6 humano é mostrada na Figura 2. As células que contêm uma deleção do gene ASAR6 4, localizada em 6q16.1, foram expostas a BrdU durante 5 horas, colhidas para células mitóticas e processados por FISH com sonda de tinta cromossoma 6 (Vysis) e para a incorporação de BrdU. Note-se que há uma diferença significativa no padrão de BrdU bandas entre os dois 6, o que é consistente com um atraso no tempo de replicação de> 2 horas para u...
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Discussão
A preparação dos spreads cromossoma é um passo crítico para o ensaio de replicação de temporização-sucedido descrito aqui. A inclusão de um passo de pré-tratamento antes da colcemida tratamento hipotónico pode auxiliar na frequência e propagação de células em mitose. Nós normalmente expor as células a colcemdi durante 1-3 horas antes da colheita, e usar colcemida, a uma concentração final de 10 ug / ml. No entanto, a inclusão de um passo de pré-tratamento colcemida podem alterar o comprimento de G2 e consequentemente, p...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional do Câncer, CA131967.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de Catálogo | Comentários (opcional) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 ug / ul |
| Nick Tradução Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Espectro laranja dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varia | |
| LSI / WCP tampão de hibridação | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP tampão de hibridação | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Cromossomo paints | MetaSystems Grupo | D-14NN-050-TR | |
| Microscópio Olympus BX61 Fluorescente | Olimpo | BX61TRF-1-5 | |
| Microscópio sistema de software de imagem | Aplicada imagem | Cytovision 3.93.1 | |
| Câmera Digital | Olimpo | UCMAD3 | |
Em receitas de hibridação in situ 35 ml formamida * (Sigma) * É importante a utilização de formamida que foi armazenado a -20 ° C. Temperatura de armazenamento prolongado sala vai gerar ácido fórmico e do pH wmal estar muito baixa. 50% Formamide/2x SSC 25 ml de formamida (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g de NaCl (Sigma) PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Fazer uma solução 0,1 M de cada de fosfato de sódio (Filtrar esterilizar e armazenar em alíquotas de 500 ml). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g de NaH 2 P0 4 (Sigma): 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g de NaH 2 P0 4 (Sigma) PN: Ajustar o pH de 0,1 M de Na 2 HP0 4 a pH 8,0 com 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtrar esterilizar e adicionar 1 ml de NP-40. PNM 50 ml 1,25 g de leite seco não gordo (Sigma) Mistura-se durante 15-20 minutos com agitação constante. 2 vezes girar a 400 xg durante 10 min. Use sobrenadante, e certifique-se de não perturbar as proteínas do leite precipitados. |
Referências
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Reimpressões e permissões
