Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4422

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Artigo de método

Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos para remodelação e reparação de lesões condrais em um modelo de coelho

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DOI:

10.3791/4422

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21 de maio de 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Uma técnica experimental para o tratamento de lesões condrais no joelho do coelho é descrito. O implante de condrócitos autólogos semeadas numa matriz é um método bem aceite para a remodelação e reparação de lesões da cartilagem articular que fornecem resultados satisfatórios a longo prazo. Matrix-assistida transplante de condrócitos autólogos (MACT) oferece um método padronizado e implante clinicamente estabelecida.

Resumo

Defeitos da cartilagem articular são consideradas um importante problema de saúde porque a cartilagem articular tem uma capacidade limitada de auto-regeneração ^1. Lesões de cartilagem não tratadas levar a dor contínua, afetam negativamente a qualidade de vida e predispõem para a osteoartrose. Durante as últimas décadas, várias técnicas cirúrgicas têm sido desenvolvidos para o tratamento de tais lesões. No entanto, até agora não foi possível conseguir uma reparação completa em termos de cobertura com o defeito da cartilagem articular ou hialina de proporcionar recuperação satisfatória a longo prazo ^2-4. Portanto, as lesões da cartilagem articular continuam a ser um alvo privilegiado para técnicas regenerativas, como Engenharia de Tecidos. Em contraste com outras técnicas cirúrgicas, que muitas vezes conduzem à formação de tecido fibroso ou fibrocartilaginoso, Tissue Engineering visa restaurar completamente a complexa estrutura e as propriedades da cartilagem articular original usando o potencial condrogénico das células transplantadas. Rdesenvolvimentos ecent abriu possibilidades promissoras para terapias de regeneração da cartilagem.

A primeira abordagem baseada em células para o tratamento de cartilagem em toda a espessura ou lesões osteocondrais foi realizada em 1994 por Lars Peterson e Pad Brittberg pioneiro condrócitos autólogos clínica (ACI) ^5. Hoje em dia, a técnica está bem estabelecido clinicamente para o tratamento de grandes defeitos na cartilagem hialina do joelho, mantendo bons resultados clínicos até 10 a 20 anos após a implantação ^6. Nos últimos anos, o implante de condrócitos autólogos foram submetidos a uma rápida progressão. O uso de um tridimensional colagénio matriz artificial no qual as células são replantadas subsequentemente transformou-se cada vez mais popular ^7-9.

MACT composto por dois procedimentos cirúrgicos: Em primeiro lugar, a fim de recolher os condrócitos, uma biópsia da cartilagem precisa ser realizada a partir de uma área de cartilagem não peso-rolamento de tjoint ele joelho. Em seguida, os condrócitos a ser extraídos, purificados e expandiu-se para um número suficiente de células in vitro. Os condrócitos são então semeadas em uma matriz tridimensional e pode ser subsequentemente re-implantado. Ao preparar um implante de tecido de engenharia, a taxa de proliferação e capacidade de diferenciação são fundamentais para a regeneração de tecidos bem sucedida ^10. A utilização de uma matriz tridimensional, como uma célula transportadora é pensado para apoiar estas características celulares ^11.

O protocolo a seguir vai resumir e demonstrar uma técnica para o isolamento de condrócitos a partir de biópsias de cartilagem, a sua proliferação in vitro e a sua sementeira em um 3D-matriz (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Suíça). Finalmente, a implantação das células-matriz-construções em defeitos condrais criadas artificialmente de articulação do joelho de um coelho vai ser descrito. Esta técnica pode ser usada como uma configuração experimentalpara novas experiências de reparação da cartilagem.

Protocolo

A. Cartilagem Biópsia (Room Cirurgia; passos 1-5 na sala de preparação não-estéril)

Realizar um controlo de peso final do coelho (coelho branco da Nova Zelândia, fêmea, 3,5-4,0 kg de peso corporal, 6 meses de idade) a fim de ser capaz de drogas de dose adequada e para monitorar o peso após a cirurgia.
Induzir a anestesia ao coelho por uma injecção intravenosa de 10 mg / kg de propofol.
Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg por via intravenosa de fentanil. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca.
Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele.
Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada.
Palpar a patela e realizar uma incisão medial da patela.
Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Tente evitar qualquer corte pequeno suvasos sanguíneos perficial.
Deslocar a patela lateralmente.
Inspecione a articulação do joelho para eventuais anomalias e lesões de cartilagem macroscópicos.
Retire cuidadosamente pequenos pedaços de cartilagem (2-3 mm) para fora da tróclea femoral ossis com um bisturi estéril (Figura 1).
Colocar imediatamente estas biópsias da cartilagem num tubo de 50 ml com meio completo (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para continuar com o direito em cultura in vitro, após a operação.
Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril.
Mude a posição da patela dentro do sulco da tróclea.
Fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl). Use material de sutura absorvível.
Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água.

B. In vitro Cultura

Processar a biópsia cpeças artilage o mais rapidamente possível após a operação em um fluxo laminar tecido capa de cultura estéril.
Lava-se a estéril colhida cartilagem 2x em PBS com subsequente centrifugação a 500 xg durante 3 minutos, à TA.
Cortar cartilagem em pedaços de 1 mm, ^3, a transferência para um Falcon de 50 ml e digerem num agitador durante 30 min com 10 ml de tripsina-EDTA (0,25%) e 10 ml de PBS durante 30 min
Após 30 minutos, parar a tripsinização adicionando meio completo. Então, agite as peças de cartilagem para o outro para 12 horas com colagenase A (0,21 U / mg) em meio livre de soro (DMEM + 1% Pen / Strep).
Centrifugar a solução resultante a 170 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente.
Ressuspender sedimentos celulares em 5 ml de meio completo.
Semente os condrócitos isolados sobre a 25 cm ² frascos de cultura de tecidos em 5 ml de meio completo e manter numa incubadora de cultura de tecidos humidificada a 37 ° C, 5% de CO _2.
Cresça condrócitos a uma densidade de 80%.
Solte a células ffrascos rom por lavagem em PBS 2x antes de expor a 0,05% de tripsina-EDTA por 3 minutos. Uma vez que os condrócitos separar, parar de tripsinização pela adição de 10 mL médio completo.
Centrifugar a suspensão a 300 xg (3 minutos) e ressuspender o pellet em meio completo.
Células de sementes em frascos de cultura de tecidos (75 cm ²⁾ e por partes a uma razão de 1:3 (~ 5.000 células / cm ²⁾ a cada 5 ^{° dia} ou ao 80% de confluência.
Determinar o número de células e viabilidade de tripan coloração azul.

C. Cell-semeadura da Matriz

Antes da implantação de lavagem e as células de libertação, tal como descrito acima. Efectuar a contagem de células e transferir 5 x 10 ⁴ células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Depois centrifugar a 500 xg durante 5 min à TA.
Ressuspender o sedimento em 15 mL meio completo para uma completa saturação da matriz.
Corte a bicamada colágeno andaime para as dimensões exatas do defeito trochlear por uma biópsia estérilsoco.
Matriz lugar num prato de cultura de tecido de tamanho adequado (por exemplo, placas de 24 poços).
Células de semente para o lado poroso, por células da matriz adesiva. Isto impede a migração de células para longe da matriz.
Adicione matrizes de células semeadas, sem mais meio de cultura de células dentro de uma incubadora durante 1 hora para permitir a aderência completa dos condrócitos.
Em seguida, coloque célula-matriz-construções em recipientes de cultura (por exemplo, placas de 24 poços) com meio completo fresco. Tome cuidado para não lavar as células fora da matriz, mesmo que forte adesão é esperado.
Agora, célula-matriz-construções podem ser levados para a sala de cirurgia para re-implantação.

D. Matrix-assistida Transplante autólogo de condrócitos

Realizar artrotomia parapatelar ao joelho contralateral como acima descrito (A. 1-8).
Criar dois defeitos condrais isoladas no sulco troclear com um operatin ar estérilg furadeira (3,6 mm de diâmetro).
Limpar o defeito e lavar com solução salina estéril.
Deve ser dada atenção para não abrir a cavidade da medula, a qualquer momento. Se necessário, vedar a parte inferior dos defeitos com cauterização eléctrica contra a hemorragia.
Implante as matrizes semeados com os condrócitos de cultura com o lado poroso virados para baixo (Figura 2). Em seguida, pressione-se encaixam nos furos e lave a superfície circundante.
Vedar as matrizes implantados com um pouco de cola de fibrina (Tissucol Duo S) para garantir a fixação segura.
Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e aplicar gama completa de movimento para a articulação do joelho algumas vezes.
Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verifique se há algum evento ou sinal de fixação instável. As matrizes devem ser realizadas ainda no local.
Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas e spray de vestir, como descrito acima.