Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

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DOI:

10.3791/4423

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21 de maio de 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de célula-coágulos In vitro Oferece um método padronizado para a implantação.

Resumo

O tratamento de defeitos articulares osteocondrais tem desafiado os médicos há muitos anos. A melhor compreensão das interações entre a cartilagem articular e o osso subcondral nos últimos anos levou a uma atenção crescente para a restauração de toda a unidade osteocondral. Em comparação com lesões condrais, a regeneração de defeitos osteocondrais é muito mais complexa e representa um desafio cirúrgico e terapêutico muito maior. O tecido danificado não inclui apenas a camada superficial de cartilagem, mas também o osso subcondral. Para danos profundos, de caráter osteocondral, como ocorre, por exemplo, na osteocondrose dissecante, toda a espessura do defeito precisa ser substituída para restaurar a superfície articular ¹. Os procedimentos terapêuticos adequados devem levar em conta esses dois tecidos diferentes e seus distintos potenciais de cicatrização intrínsecos ². Nas últimas décadas, surgiram diversas opções de tratamento cirúrgico, já estabelecidas clinicamente ^3-6.

Transplantes osteocondrais autólogos ou alogênicos consistem em cartilagem articular e osso subcondral e permitem a substituição de toda a unidade osteocondral. Os defeitos são preenchidos com enxertos osteocondrais cilíndricos que visam proporcionar uma superfície contínua revestida por cartilagem hialina ^3,7,8. As desvantagens incluem a quantidade limitada de enxertos disponíveis, a morbidade no local doador (para transplantes autólogos) e a incongruência da superfície; assim, a aplicação deste método é especialmente limitada em defeitos extensos.

Novas abordagens na área da engenharia de tecidos abriram possibilidades promissoras para a terapia regenerativa osteocondral. A implantação de condrócitos autólogos marcou o primeiro enfoque biológico baseado em células para o tratamento de lesões cartilaginosas em espessura total e está agora estabelecida mundialmente, com bons resultados clínicos mesmo 10 a 20 anos após a implantação ^9,10. No entanto, até o momento, esta técnica não é adequada para o tratamento de todos os tipos de lesões, como defeitos profundos que envolvem o osso subcondral ¹¹.

A técnica do sanduíche combina enxertia óssea com abordagens atuais em Engenharia de Tecidos ^5,6. Essa combinação parece ser capaz de superar as limitações observadas apenas nos enxertos osteocondrais. Após a enxertia óssea autóloga na área do defeito subcondral, uma membrana semeadas com condrocitos autólogos é suturada acima, facilitando o ajuste da topologia do enxerto ao local lesionado. É claro que a reconstrução óssea prévia exige tempo cirúrgico adicional e, muitas vezes, até mesmo uma cirurgia adicional. Além disso, até o momento, faltam dados de longo prazo ¹².

A engenharia de tecidos sem enxerto ósseo adicional tem como objetivo restaurar a estrutura complexa e as propriedades da cartilagem articular nativa por meio do potencial condrogênico e osteogênico das células transplantadas. No entanto, mais uma vez, geralmente é apenas o tecido cartilaginoso que é mais ou menos regenerado. Danos osteocondrais adicionais exigem um tratamento específico adicional. Para alcançar a regeneração da estrutura multilamelar de defeitos osteocondrais, produtos tridimensionais de engenharia de tecidos semeados com células autólogas/alogênicas podem proporcionar uma boa capacidade regenerativa ¹¹.

Além dos condrócitos autólogos, as células-tronco mesenquimais (MSC) parecem ser uma alternativa atraente para o desenvolvimento de um tecido cartilaginoso de espessura total. Em inúmeros estudos pré-clínicos in vitro e in vivo, as células-tronco mesenquimais demonstraram excelente potencial de regeneração tecidual ^13,14. A vantagem importante das células-tronco mesenquimais, especialmente para o tratamento de defeitos osteocondrais, é que elas têm a capacidade de se diferenciar em osteócitos, bem como em condrócitos. Portanto, elas permitem potencialmente uma regeneração multilamelar do defeito.

Nos últimos anos, diversos scaffolds com potencial regenerativo osteocondral foram desenvolvidos e avaliados, apresentando resultados preliminares promissores ^1,15-18. Além disso, a cola de fibrina como veículo para células tornou-se uma das técnicas preferidas na reparação experimental da cartilagem e já foi utilizada com sucesso em diversos estudos em animais ^19-21 e até em primeiros ensaios em humanos ²².

O protocolo a seguir demonstrará uma técnica experimental para o isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea de um coelho, para subsequente proliferação em cultura celular e para a preparação de um modelo padronizado in vitro de coágulos de fibrina e células. Por fim, será descrita uma técnica para a implantação de coágulos de fibrina e células previamente estabelecidos em defeitos osteocondrais artificiais da articulação do joelho do coelho.

Protocolo

A. Preparação de um coelho de Doadores para o isolamento de células tronco mesenquimais (Room Cirurgia)

As células são isoladas Nova Zelândia Branco (NZW) coelhos machos em idade de 4 meses e cerca de 3 kg de peso corporal.
Induzir a anestesia de propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) e sacrificam com pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal iv).
Barbear pele de membros posteriores, costas e barriga com um cortador elétrico e aspirar o pêlo.
Desinfectar a área raspada cuidadosamente com etanol a 70%.
Use uma pinça sem corte, tesouras afiadas (ou bisturi) e cortadores de ossos para o tecido e ligamentos.
Faça uma incisão ao longo da superfície craniana da perna e panturrilha.
Refletir pele e tecido subcutâneo por qualquer dissecção cortante ou contundente.
Músculos separados e ligamentos de tíbia e fêmur. Mantenha cortes tão perto do osso possível para fazer uma dissecação limpa. Não separe fêmur da tíbia neste momento.
Corte through da articulação do quadril para separar a cabeça do fêmur do acetábulo.
Eleve o complexo tíbio-femoral.
Use a lâmina de bisturi para raspar qualquer tecido mole restante dos ossos ou esfregar os ossos com tecidos de pano estéreis. Neste ponto, do fémur e da tíbia ainda estão ligados.
Remover patela por corte, em seguida, corte os ligamentos da articulação do joelho para ossos separados, finalmente.
Spray de ossos separados com etanol a 70%, deixar secar ao ar e colocar cada osso para um tubo de centrífuga de 50 ml com meio de cultura celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para mantê-los húmidos.
Agora mude em uma cultura de células capela de fluxo laminar estéril.

B. Flushing de Coelho MSC a partir de ossos e Expansão (Cultura capa de celular)

Recolher os ossos a partir de tubos e colocá-los em 150 pratos mm usando uma pinça estéril.
Retire duas extremidades ósseas com uma serra estéril e peças mudar para Nova milímetros pratos 150.
Encha uma seringa de 10 ml com medium (DMEM), coloque uma agulha de calibre 18 e inserir na abertura da medula óssea.
Em seguida, enxágüe cavidade medular com meio para liberar a medula óssea para o prato. Depois, enxaguar partir da outra extremidade, se possível. Se necessário, viu fora mais das extremidades. Se o osso deve quebrar, basta lavar o interior do osso.
Aspirar o meio de suspensão de células para dentro da seringa e enxaguar a medula óssea repetidamente até que a suspensão é de flutuação livre, através da cavidade da medula óssea e não mais de medula óssea coágulos aparecer.
Uma vez que a medula óssea foi coletada a partir de todos os ossos, romper os aglomerados de medula, passando por uma agulha de calibre 18: encher a seringa com agulha acoplada e forçar a saída em média.
Em seguida, filtrar a suspensão através de um filtro de células num tubo de 50 ml. A fim de evitar a perda de células, lava prato de cultura 2x com 10 ml de meio e filtrar bem.
Centrifugar a suspensão a 500 xg durante 5 min à TA.
Remover o sobrenadante e ressuspender célula pellet em 10 ml de meio (DMEM + 1% de Pen / Strep).
Células do sangue em separado do sangue células mononucleares periféricas (PBMC) e células-tronco mesenquimais (MSC) usando uma solução de separação Biocoll.
Encha 5 ml de solução de separação Biocoll num tubo de 15 ml e adiciona cuidadosamente 5 ml de suspensão de células no topo e centrifugar a 800 xg durante 20 min à temperatura ambiente (sem travagem).
Resultados possíveis veja a Figura 1: Sendo mais denso que Biocoll, as células vermelhas do sangue de sedimentos para o fundo, enquanto as células-tronco mesenquimais de PBMC e permanecer na interface.
Retire cuidadosamente da interface em um tubo de 15 ml e lavar com 5 ml PBS.
Centrifugar como descrito no passo 22, ressuspender em 5 ml de PBS e repetir 2-3x.
Depois, centrifugar novamente a 350 xg durante 10 min à temperatura ambiente (com travão).
Ressuspender em 10 ml de meio e contagem de células num hemocitómetro.
As células em placas a uma densidade de sementeira inicial de aproximadamente 5 x 10 ⁶ em 150 milímetros pratos.
Depois de 2-3 dias, remover as células não aderentes. Pode ser necessário enxaguar com PBS primeiro, a fim de remover os detritos celulares. Adicionar meio completo fresco (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de Pen / Strep) depois.
Alimentar as células a cada 3-4 dias (Figura 2).
Depois de 5-10 dias, as células de passagem para a primeira vez.

C. Preparação de coágulos de fibrina in vitro

No dia da implantação, as células aderentes libertar a partir de frascos / pratos por 3 minutos de exposição a 0,25% de tripsina-EDTA. Parar a tripsinização adicionando meio completo.
Distribua as células em um tubo de 50 ml falcon e lavá-los duas vezes com PBS.
Determinar a viabilidade celular e os números de tripan coloração azul.
Adicionar 50.000 células / tubo de microcentrífuga e recolher pelotas por centrifugação a 500 xg durante 5 min à TA. Prepare um mastermix para pelo menos mais um coágulo, conforme necessário.
Ressuspender o sedimento celular em 17 ul de PBS e 25 ul de misturar o componente de fibrinogénio TISSUCOL-17 Kit com esta suspensão MSC mL.
Aqui uma placa estéril com orifícios pré-perfurados (3x3.6 mm) de acordo com os furos in vivo (Figura 3).
Primeiro, inocular 4 ul solução de trombina (500 UI / ml) para um orifício, seguida pela adição imediata de 42 ul de fibrinogénio à suspensão de células e novamente 4 ul de solução de trombina de topo. Não misturar a suspensão para evitar a coagulação na ponta da pipeta. Em primeiro lugar, o volume de 50 ul da pipetado fibrinogénio células suspensão irá sobressair o aro dos orifícios pré-perfurados, sem fusão, devido à tensão superficial. No entanto, depois de concluída a coagulação (após 60 min), o coágulo é contrair e se encaixa no furo pré-furado.
Remover o coágulo com cuidado usando uma pinça sem corte e coloque em um tubo de microcentrífuga com PBS. Preparar dois coágulos / animal.
Pegue os coágulos para a sala de cirurgia.

D. Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Para induzir a anestesia de coelho (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de idade) por injecção intravenosa de propofol (10 mg / kg de peso corporal).
Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele. Todos os procedimentos nomeados antes são realizados em uma sala de preparação de uma cirurgia para evitar a contaminação do ambiente estéril da sala de cirurgia.
Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg / min de fentanil intravenosamente. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca.
Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada.
Palpar a patela e realizar uma incisão medial à patela.
Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Evite cortar qualquer pequenos vasos sanguíneos superficiais.
Deslocar lateralmente a patela (Figura 4).
Depois de inspecção da articulação do joelho por quaisquer lesões de cartilagem concomitantes ou anomalias articulares, criar dois defeitos osteocondrais (3 mm de profundidade, figura em forma de oito), no sulco troclear com um ar furadeira operacional estéril (3,6 milímetros de diâmetro) com um dispositivo de paragem (Figura 5).
Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril.
Antes da implantação, encher 20 ul de cola de fibrina para os defeitos e distribuí-las uniformemente sobre o fundo do defeito.
Em seguida, implantar os coágulos press-montado na figura defeito em forma de oito.
Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e dobrar e esticar o joelho algumas vezes.
Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verificar se células-coágulos de fibrinogênio ainda estão no local.
Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl) (ambos com fio absorvívelde material).
Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água.
Para os cuidados pós-operatórios, a ferida é verificada por dia durante 7 dias. Os coelhos recebem por analgesia pós-operatória Carprofeno 4 mg / kg sc a cada 24 h (durante 4 dias) e buprenorfina 0,03 mg / kg sc a cada 12 h (durante 2,5 dias). A estabilização do joelho (por exemplo, limpeza) não é necessária.