Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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Artigo de método

Tratamento de defeitos osteocondrais no Joelho do Coelho por Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina

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DOI:

10.3791/4423

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21 de maio de 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de célula-coágulos In vitro Oferece um método padronizado para a implantação.

Resumo

O tratamento de defeitos articulares osteocondrais tem desafiado os médicos há muitos anos. A melhor compreensão das interações entre a cartilagem articular e o osso subcondral nos últimos anos levou a uma atenção crescente para a restauração de toda a unidade osteocondral. Em comparação com lesões condrais, a regeneração de defeitos osteocondrais é muito mais complexa e representa um desafio cirúrgico e terapêutico muito maior. O tecido danificado não inclui apenas a camada superficial de cartilagem, mas também o osso subcondral. Para danos profundos, de caráter osteocondral, como ocorre, por exemplo, na osteocondrose dissecante, toda a espessura do defeito precisa ser substituída para restaurar a superfície articular ¹. Os procedimentos terapêuticos adequados devem levar em conta esses dois tecidos diferentes e seus distintos potenciais de cicatrização intrínsecos ². Nas últimas décadas, surgiram diversas opções de tratamento cirúrgico, já estabelecidas clinicamente ^3-6.

Transplantes osteocondrais autólogos ou alogênicos consistem em cartilagem articular e osso subcondral e permitem a substituição de toda a unidade osteocondral. Os defeitos são preenchidos com enxertos osteocondrais cilíndricos que visam proporcionar uma superfície contínua revestida por cartilagem hialina ^3,7,8. As desvantagens incluem a quantidade limitada de enxertos disponíveis, a morbidade no local doador (para transplantes autólogos) e a incongruência da superfície; assim, a aplicação deste método é especialmente limitada em defeitos extensos.

Novas abordagens na área da engenharia de tecidos abriram possibilidades promissoras para a terapia regenerativa osteocondral. A implantação de condrócitos autólogos marcou o primeiro enfoque biológico baseado em células para o tratamento de lesões cartilaginosas em espessura total e está agora estabelecida mundialmente, com bons resultados clínicos mesmo 10 a 20 anos após a implantação ^9,10. No entanto, até o momento, esta técnica não é adequada para o tratamento de todos os tipos de lesões, como defeitos profundos que envolvem o osso subcondral ¹¹.

A técnica do sanduíche combina enxertia óssea com abordagens atuais em Engenharia de Tecidos ^5,6. Essa combinação parece ser capaz de superar as limitações observadas apenas nos enxertos osteocondrais. Após a enxertia óssea autóloga na área do defeito subcondral, uma membrana semeadas com condrocitos autólogos é suturada acima, facilitando o ajuste da topologia do enxerto ao local lesionado. É claro que a reconstrução óssea prévia exige tempo cirúrgico adicional e, muitas vezes, até mesmo uma cirurgia adicional. Além disso, até o momento, faltam dados de longo prazo ¹².

A engenharia de tecidos sem enxerto ósseo adicional tem como objetivo restaurar a estrutura complexa e as propriedades da cartilagem articular nativa por meio do potencial condrogênico e osteogênico das células transplantadas. No entanto, mais uma vez, geralmente é apenas o tecido cartilaginoso que é mais ou menos regenerado. Danos osteocondrais adicionais exigem um tratamento específico adicional. Para alcançar a regeneração da estrutura multilamelar de defeitos osteocondrais, produtos tridimensionais de engenharia de tecidos semeados com células autólogas/alogênicas podem proporcionar uma boa capacidade regenerativa ¹¹.

Além dos condrócitos autólogos, as células-tronco mesenquimais (MSC) parecem ser uma alternativa atraente para o desenvolvimento de um tecido cartilaginoso de espessura total. Em inúmeros estudos pré-clínicos in vitro e in vivo, as células-tronco mesenquimais demonstraram excelente potencial de regeneração tecidual ^13,14. A vantagem importante das células-tronco mesenquimais, especialmente para o tratamento de defeitos osteocondrais, é que elas têm a capacidade de se diferenciar em osteócitos, bem como em condrócitos. Portanto, elas permitem potencialmente uma regeneração multilamelar do defeito.

Nos últimos anos, diversos scaffolds com potencial regenerativo osteocondral foram desenvolvidos e avaliados, apresentando resultados preliminares promissores ^1,15-18. Além disso, a cola de fibrina como veículo para células tornou-se uma das técnicas preferidas na reparação experimental da cartilagem e já foi utilizada com sucesso em diversos estudos em animais ^19-21 e até em primeiros ensaios em humanos ²².

O protocolo a seguir demonstrará uma técnica experimental para o isolamento de células-tronco mesenquimais da medula óssea de um coelho, para subsequente proliferação em cultura celular e para a preparação de um modelo padronizado in vitro de coágulos de fibrina e células. Por fim, será descrita uma técnica para a implantação de coágulos de fibrina e células previamente estabelecidos em defeitos osteocondrais artificiais da articulação do joelho do coelho.

Protocolo

A. Preparação de um coelho de Doadores para o isolamento de células tronco mesenquimais (Room Cirurgia)

As células são isoladas Nova Zelândia Branco (NZW) coelhos machos em idade de 4 meses e cerca de 3 kg de peso corporal.
Induzir a anestesia de propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) e sacrificam com pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal iv).
Barbear pele de membros posteriores, costas e barriga com um cortador elétrico e aspirar o pêlo.
Desinfectar a área raspada cuidadosamente com etanol a 70%.
Use uma pinça sem corte, tesouras afiadas (ou bisturi) e cortadores de ossos para o tecido e ligamentos....