Estudo da Checkpoint Dano ao DNA usando<em&gt; Xenopus</em&gt; Os extratos de ovos

Resumo

Xenopus egg extracto é um sistema modelo útil para investigar o checkpoint danos no DNA. Este protocolo é para a preparação de extractos de ovos de Xenopus e os danos do ADN reagentes indutores de ponto de verificação. Estas técnicas são adaptáveis ​​a uma variedade de abordagens que danificam o ADN no estudo da sinalização checkpoint danificam o DNA.

Resumo

Numa base diária, as células são sujeitas a uma variedade de insultos endógenos e ambientais. Para combater esses insultos, as células desenvolveram posto de controle de danos ao DNA sinalização como um mecanismo de vigilância para detectar danos no DNA e diretos respostas celulares a danos no DNA. Há diversos grupos de proteínas chamados sensores, transdutores e efetores envolvidos na sinalização de DNA checkpoint de dano (Figura 1). Neste caminho complexo de sinalização, ATR (ATM e Rad3-relacionados) é uma das quinases importantes que podem responder a danos no ADN e stress replicação. Activated ATR pode fosforilar os seus substratos a jusante, tais como o Chk1 (Ponto de verificação quinase 1). Consequentemente, fosforiladas e activadas Chk1 conduz a muitos efeitos a jusante do ponto de verificação, incluindo danos no DNA paragem do ciclo celular, a activação da transcrição, reparação de danos do ADN, e a apoptose ou senescência (Figura 1). Quando o DNA é danificado, não para ativar o DNA resultados checkpoint danos em unrepdanos ao ar e, posteriormente, instabilidade genômica. O estudo dos danos de ADN do ponto de verificação será elucidar como as células a manter a integridade do genoma e proporcionar um melhor entendimento de como as doenças humanas, tais como o cancro, se desenvolver.

Extratos de ovos de Xenopus laevis estão surgindo como um poderoso modelo de sistema livre de células extrato no DNA pesquisa checkpoint danos. De baixa velocidade de extracto (LSE) foi inicialmente descrita por grupo Masui ^1. A adição de cromatina espermática demembranated para os resultados na formação de núcleos de LSE, onde o DNA é replicado em uma forma semiconservativa uma vez por ciclo celular.

A via de sinalização ATR/Chk1-mediated checkpoint é acionado por dano de DNA ou estresse replicação ^2. Dois métodos são usados ​​atualmente para induzir o posto danos ao DNA: abordagens de DNA e DNA danos prejudiciais imitando-estruturas ^3. Dano do ADN pode ser induzida por irradiação com ultravioleta (UV), γ-irradiação, metil metanesulfonate (MMS), mitomicina C (MMC), 4-nitroquinolina-1-óxido de (4-NQO), ou afidicolina ^{3, 4.} O MMS é um agente alquilante que inibe a replicação do DNA e ativa o ponto de verificação danos ATR/Chk1-mediated DNA ^4-7. Irradiação UV também provoca a ATR/Chk1-dependent DNA ⁸ checkpoint danos. A estrutura de ADN que imita dano-AT70 é um complexo de recozido de dois oligonucleótidos de poli-(dA) 70 e poli-(dT) 70. O sistema AT70 foi desenvolvido no laboratório Bill Dunphy e é amplamente utilizada para induzir a sinalização de checkpoint ATR/Chk1 ^9-12.

Aqui, nós descrevemos protocolos (1) para preparar extractos isentos de células de ovos (LSE), (2) para o tratamento de Xenopus com cromatina de esperma dois ADN diferentes abordagens danificar (MMS e UV), (3) para preparar o DNA de danos estrutura imita AT70, e (4) para accionar o ponto de verificação ATR/Chk1-mediated danos no DNA LSE com cromatina espermática danificado ou uma estrutura de ADN que imita danos.

Protocolo

1. Preparação LSE

1. Rãs do sexo feminino (Xenopus laevis) são injetadas duas vezes para coleta de ovos. A primeira injecção (ferragem) é de 100 U PMSG (gonadotrofina de égua prenhe) por sapo. Rãs deve ser preparada pelo menos dois dias antes de ovo indução assentamento e rãs condicionadas são utilizáveis ​​por até duas semanas. Para rãs primos, injetar por via subcutânea PMSG nos sacos linfáticos dorsal usando uma seringa de 3 ml e 27 agulha G.
2. Para induzir a postura de ovos, injetar 500 U hCG (gonadotrofina coriônica humana) por sapo preparado por via subcutânea nos sacos linfáticos dorsal usando uma agulha de 27 G. Incubar rãs injetados ....

Discussão

Existem várias vantagens em estudar o posto danos no DNA utilizando extratos de Xenopus ovo. A utilização de extractos de ovo fornece uma grande quantidade de extractos livres de células sincronizadas em interfase do ciclo celular. Os extractos de ovos pode ser feita fácil e barata. É relativamente fácil para danificar o DNA ou cromatina e revelar um defeito no ponto de verificação, após danos no ADN immunodepleting uma proteína alvo a partir de extracto de ovo. Subsequentemente, um defeito da função potencial .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			Reagentes
Anticorpo anti-P-Chk1 S344	Sinalização celular	2348L
Anticorpo anti-Chk1	Santa Cruz	SC7898
Aprotinina	Biomedicals MP	0219115880
Cicloheximida	Sigma	C7698-5G
Citocalasina B	EMD	250233
Ditiotreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cisteína	Sigma	C7352-1KG
Leupeptina	VWR	97063-922
Metanossulfonato de metilo (MMS)	Sigma	129.925-5G
Nocodazol	Sigma	M1404-2mg
PMSG	Calbiochem	367222
Tampão de amostra	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals EUA	209-12041
			Equipamento
Balde para a postura de ovos	Produtos Rubbermaid comerciais	6308
CL2 centrífuga IEC com rotor basculante	Thermo Scientific	004260F
HB6 rotor de caçamba móvel	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 mais centrífuga superspeed	Thermo Scientific	46910
Reticulador UV	UVP	95-0174-01
			Soluções
1x MMR			100 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 0,5 mM de MgSO4, 2,5 mM de CaCl 2, 5 mM de HEPES, pH ajustado a 7,8 com NaOH 10 M
Aprotinina / estoque Leupeptin			10 mg / ml de cada uma em água. Armazenar 20 ul de aliquotas a -80 ° C.
Tampão X			0,2 M de sacarose, 80 mM de KCl, 15 mM NaCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 10 mM de HEPES, pH ajustado a 7,5 por HCl
Estoque cicloheximida			10 mg / ml em água. Loja de aliquotas de 1 ml a -20 ° C.
Citocalasina B estoque			5 mg / ml em DMSO. Armazenar 20 ul de aliquotas a -20 ° C.
Ditiotreitol estoque (TDT)			1 M em água. Loja de aliquotas de 1 ml a -20 ° C.
ELB			Sacarose 0,25 M, 1 mM de DTT, 50 ug / ml de cicloheximida, 2,5 mM MgCl2, 50 mM de KCl, 10 mM de HEPES, pH7.7
Nocodazol estoque			10 mg / ml em DMSO. Armazenar aliquotas de 5 uL a -80 ° C.
Mistura de energia			375 mM de fosfato de creatina, ATP 50 mM e 25 mM de MgCl 2. Alíquotas são guardadas a -80 ° C.
Solução de corante nuclear			0,4 ug / ml de Hoechst 33258 de glicerol, 25%(V / v), em PBS 1x
Estoque Tautomycin			100 uM em DMSO. Armazenar aliquotas de 10 uL a -80 ° C.