Ao marcar os domínios extracelulares dos receptores de membrana com pHluorin superecliptic, e por imagiologia estes receptores de fusão em neurónios de rato em cultura, pode-se visualizar directamente os eventos de inserção individuais vesiculares dos receptores na membrana plasmática. Esta técnica será útil para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a inserção do receptor para a membrana plasmática.
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Artigo de método
Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma melhor compreensão dos mecanismos que regem o tráfico receptor entre a membrana do plasma (PM) e compartimentos intracelulares requer uma abordagem experimental, com excelentes resoluções espaciais e temporais. Além disso, esta abordagem também deve ter a capacidade de distinguir os receptores localizados na PM daqueles em compartimentos intracelulares. Mais importante ainda, a detecção de receptores de uma vesícula única requer excelente sensibilidade de detecção, uma vez que cada vesícula leva apenas um pequeno número de receptores. Abordagens normalizadas para examinar o tráfico receptor incluem a biotinilação da superfície seguido de detecção bioquímica, que carece tanto as resoluções necessárias espaciais e temporais, e exame de microscopia de fluorescência de receptores de superfície, o que requer immunolabeled fixação química de células e, portanto, carece de resolução temporal suficiente 1-6. Para superar essas limitações, nós e outros têm desenvolvido e utilizado um novo stratégia que permite a visualização da inserção dinâmica de receptores para a PM, com excelentes resoluções espaciais e temporais 7-17. A abordagem inclui a marcação de uma GFP sensível ao pH, o pHluorin superecliptic 18, para o domínio N-terminal extracelular de receptores. Superecliptic pHluorin tem a propriedade única de ser fluorescente a pH neutro e não fluorescente a pH ácido (pH <6,0). Portanto, os receptores marcados são não-fluorescente quando dentro do lúmen ácida tráfico de vesículas intracelulares ou compartimentos endossomais e tornam-se facilmente visualizado apenas quando exposto ao ambiente extracelular pH neutro, na superfície exterior do PM. Nossa estratégia, consequentemente, permite-nos distinguir receptores de superfície PM daqueles dentro de vesículas tráfico intracelular. Suficientes para alcançar resoluções espaciais e temporais, bem como a sensibilidade necessária para estudar o tráfico dinâmica dos receptores, foram empregados interna total reflectemion microscopia fluorescente (TIRFM), o que nos permitiu obter a melhor resolução espacial da imagem óptica (~ 170 nm), a resolução temporal do vídeo de taxa de microscopia (30 quadros / seg), e a sensibilidade para a detecção de fluorescência de uma única GFP molécula. Pela imagem pHluorin-marcado receptores sob TIRFM, fomos capazes de visualizar diretamente eventos receptores individuais inserção na PM em neurônios cultivados. Esta abordagem de imagem pode, potencialmente, ser aplicada a qualquer proteína de membrana com um domínio extracelular que poderiam ser marcadas com pHluorin superecliptic, e permitirá a dissecação dos mecanismos chave de pormenor que regem a inserção de proteínas de membrana diferentes (receptores, canais de iões, transportadores, etc) para da PM.
Protocolo
1. Preparando Cultura Glia Rato para o condicionamento de Cultura Neuronal
- Frascos T75 são revestidos com uma solução de colagénio (1:3 diluição de Purecol em DDH 2 O). Os frascos são erguidas e deixa-se secar durante a noite numa câmara de cultura de tecidos.
- Tampão dissecção (aCSF: 119 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl2, 30 mM de glicose, 25 mM de HEPES, pH 7,4, sem cálcio) e os meios da glia (DMEM suplementado com 10% de FBS, 10 unidades / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina, e Glutamax) são preparadas e armazenadas a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
- No dia da cultura as células gliais, os meios de comunicação glia é aquecida durante pelo menos 30 min em banho de água a 37 ° C antes da dissecação de cérebros de ratos. Ratos embrionários ou neonatais são sacrificados por decapitação rápida. Córtex cerebral são dissecados sob um microscópio de dissecação.
- Tecidos cerebrais dissecados são digeridas em solução de papaína (100 ml de papaína e 20 ul de 1% de DNase I, em 2 ml de tampão de dissecção) a 37 ° C for 20 min.
- Após a digestão com papaína, tecidos cerebrais são lavados com 10 ml de meio pré-aquecido da glia. Media glia frescas (2 ml) é então adicionado aos tecidos cerebrais digeridos, e os tecidos são triturados com uma chapa de vidro polido ao fogo pipeta de Pasteur.
- Meios frescos glia (8 ml) é adicionado aos tecidos dissociados. A 70 uM de células-filtro é usado para filtrar a suspensão de tecido dissociado. As células são então semeadas em frascos T75 (geralmente 2-3 embriões pode semear um frasco T75), e colocados em um de 37 ° C célula incubadora de cultura.
- No dia seguinte, os meios de comunicação a partir dos frascos T75 é aspirado. Os balões são lavados com 10 ml de PBS. Media glia frescos (10-15 ml) é então adicionado a cada frasco.
- Dentro de 10-12 dias, as células gliais nos frascos T75 deve ser confluente. As células gliais são lavadas com PBS, e de 5 ml de tripsina a 0,05% é adicionado a cada frasco T75.
- Após incubação com tripsina a 37 ° C durante 5 minutos, as células gliais são células dissociadas e glial de cada frasco T75 são divididos em doisdiferentes de colagénio revestidos frascos T75.
- Inserções de cultura (Millipore PICM03050) são preparados colocando-as em placas de 6 poços, revestindo-os com o colagénio, e o ar de secagem durante a noite. Media glia (2 ml cada) é colocado por baixo de cada inserção de cultura.
- Glia de frascos T75 confluentes são tripsinizadas e semeadas sobre as inserções de cultura (de um frasco T75 por placa de 6 poços, 2 ml cada inserção). Estas inserções de cultura glia será utilizada para condicionar as culturas neuronais.
2. Cultura neuronal
- As lamelas de vidro para cultura neuronal são limpos por imersão em 70% HNO 3, pelo menos durante a noite. As lamelas são em seguida lavadas com DDQ 2 O, pelo menos, 3 vezes, e secou-se num forno Isotemp (> 200 ° C) durante a noite.
- Lamelas limpos são colocados numa placa de 6 poços, uma lamela por poço. As lamelas são revestidas com poli-L-Lisina a solução (2 ml, 0,1% em 100 mM de ácido bórico, pH = 8,5) durante a noite numa incubadora a 37 ° C.
- Opoli-L-lisina solução é removida e as lamelas lamelas foram lavadas 3 vezes com autoclavado DDH 2 O. As lamelas são em seguida incubadas numa incubadora a 37 ° C durante a noite em meio de plaqueamento (Neurobasal suplementado com soro de cavalo a 5% inactivado pelo calor, a 10 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 10 ug / ml, Glutamax, 2% B27 suplemento é adicionado ao meio de plaqueamento no dia em que é usado).
- No dia seguinte, o meio de revestimento é removida e 2 ml de meio fresco com chapeamento B-27 é adicionada a cada poço que tem uma lamela de vidro.
- Ratas grávidas (E15-18) são sacrificados com CO 2, e os ratos embrionárias são sacrificados por decapitação. O hipocampo ou estriado é dissecado a partir do tecido cerebral e colocados em um tubo de 15 ml com tampão arrefecido com gelo de dissecação, para a cultura de neurónios do hipocampo ou do estriado neurónios espinhosos médios, respectivamente.
- Tecidos cerebrais dissecados são dissociados com papaína, tal como descrito nas etapas 1.4) e 1.5).
- Fepois de dissociação, o número de células em cada suspensão neuronal é contado com um hemocitómetro. Os neurónios são então semeadas em cada lamela, a uma densidade de 0,4 x 10 6 células por poço de uma placa de 6 poços, e cultivadas numa incubadora a 37 ° C durante a noite (neurónios são DIV 0).
- Para preparar inserções de cultura condicionado por células gliais as culturas neuronais, os meios de comunicação glia é removido das inserções de cultura de células da glia e meio de revestimento fresco é adicionado (2 ml na inserção e 2 ml por baixo da inserção).
- No dia seguinte (DIV 1), com lamelas de neurónios são colocadas por baixo das inserções de cultura da glia, um lamínulas em cada poço.
- Os neurónios são alimentados com metade do volume de meio fresco pré-aquecido com alimentação (B-27) a cada 3-4 dias até que estejam prontos para experiências de transfecção e de imagem.
3. Transfecção
- Neuronal transfecção é realizada utilizando Lipofectamine 2000. Para cada cultura neuronal (uma cultura por cada lamela), 2 ulLipofectamine 2000 e 1 ug de ADN são utilizados. Meio Neurobasal fresco, sem suplemento é usado para diluir a Lipofectamina e DNA.
- DNA Lipofectamine e são incubadas durante 20 min à temperatura ambiente após a mistura.
- Salve 1 ml dos meios de comunicação de baixo cada inserção da cultura glia, e 1 ml de dentro de cada inserção, e transferir a mídia para um tubo cônico. Adicionar o mesmo volume de meio de alimentação + B27 para o meio de salva, e incubar a 37 ° C. Este meio é utilizado para a cultura neuronal após transfecção.
- Seguindo a incubação de 20 min Lipofectamine / DNA, as inserções de cultura são removidas da glia momentaneamente a partir das placas de 6 poços. A mistura de Lipofectamine 200 / ul de ADN é adicionado a cada lamela com neurónios. As inserções de cultura de células gliais são então devolvidos a cada poço, acima dos neurónios. Geração de bolhas sob a membrana das inserções de cultura deve ser evitado. Os neurónios são incubadas com a mistura de Lipofectamine / DNA a 37 ° C durante 2-4 hr.
- Depois ªe 2-4 hr período de incubação, as inserções são removidas novamente da glia. Os meios de cultura com a mistura de Lipofectamine / DNA é removida de cada poço. Os meios de comunicação guardados no passo 3.3) é adicionada a neurónios (2 ml por poço). Inserções de cultura glia são devolvidos a cada poço, e os meios de comunicação glia de cada inserção é removido, e 2 ml de meios de comunicação a partir do passo 3.3) é adicionado em cada pastilha.
- Os neurónios são cultivados durante uma hora adicional a 24-72 permitir a expressão de ADNc transfectado antes TIRF imagem é executada no estes neurónios.
4. TIRF imagem
- Fluido cerebrospinal artificial (aCSF: 119 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM de glicose, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES, pH = 7,4) será utilizado para geração de imagens ao vivo experimentos. Nosso sistema de imagem TIRF é costume set-up com um 100-mW Ciano laser para excitação, e uma carga do elétron Multiplicando Juntamente câmera do dispositivo (EMCCD) para um detector.
- Antes de experimentos com imagens, o aCSF é advertido em um 37 & dpor exemplo, C banho de água durante pelo menos 30 min. O inserto para geração de imagens ao vivo de aquecimento é colocada na platina do microscópio, e a inserção de aquecimento, laser, câmara e são aquecidos durante pelo menos 30 minutos antes do início das experiências de imagiologia.
- A lamela com os neurônios transfectadas é montado na câmara ao vivo de imagens. O aCSF pré-aquecido é colocado na câmara depois da câmara é montada, esta etapa deve ser completado tão rapidamente quanto possível.
- Uma vez que a câmara é colocada sobre o inserto de aquecimento sobre a platina do microscópio, os neurónios transfectadas são identificadas visualmente sob epi-fluorescente modo de imagem.
- Após saudáveis neurônios transfectadas são identificadas (ver as Figuras 1 e 2), que normalmente executam 1 min de foto-branqueamento para eliminar preexistente pHluorin fluorescência na membrana plasmática, tal como pHluorin-receptores na membrana plasma ter níveis muito elevados de fluorescência quando TIRF imagem é iniciado, o que interfere com a visualização de ins indivíduoertion eventos.
- Seguindo Fotobranqueador, o ajuste de ganho do multiplicador de electrões na câmara EMCCD é ajustado para o máximo, e a gravação é realizada durante 1 min a 10 Hz.
- Cada gravação irá conter 600 imagens. Eventos de inserção individuais são identificadas por jogar nas costas de gravação usando ImageJ. Eventos de inserção individuais são analisados manualmente usando ImageJ.
5. Resultados representativos
Cultura neuronal consistente é a chave para o sucesso de imagem ao vivo experimentos. Figura 1 mostra os neurônios do hipocampo de rato cultivadas utilizando nosso protocolo de DIV DIV 11 a 18. É claro a partir das imagens que os neurônios se desenvolveram processos extensos e que os processos dendríticas são cobertos densamente com espinhas dendríticas, indicações de que esses neurônios são saudáveis na cultura. O protocolo de cultura pode também ser utilizado para outros tipos de neurónios no cérebro. Por exemplo, recentemente utilizado este protocolo para culturaestriado neurônios espinhosos médios em um estudo para examinar receptor de dopamina D2 (DRD2) inserção na cultura de neurônios de rato médio estriado espinhosas. 9 Figura 2 mostra rato estriado neurônios espinhosos médios cultivadas utilizando nosso protocolo em DIV 8. Temos também realizada com sucesso TIRF imagiologia de superecliptic DRD2s pHluorin-tagged neste tipo de neurónio. Figura 3 mostra a expressão de pHluorin-tagged DRD2 (pH-DRD2) num neurónio spiny médio e visualização de pH-DRD2 inserção neste neurónio.
Figura 1. Cultura do hipocampo do rato pelo método de cultura de interface. DIV: dias in vitro, o dia de cultura é considerada como DIV 0. A partir das imagens, é evidente que os neurónios do hipocampo maduros neste tipo de cultura entre 11 e DIV DIV 15. Às 11 e 13 DIV, dendrites neuronais são cobertas com espinhas filipodia e imaturas. Às 15 e DIV18, dendritos neuronais são cobertos com espinhos grandes, uma indicação de mais neurônios maduros. Painéis esquerdo: ampliação de imagens de baixa de neurônios do hipocampo de rato em diferentes idades. Painéis direito: ampliação de imagens de alta (zoom em dendritos neuronais do painel esquerdo) de processos neuronais dendríticas com espinhas dendríticas em diferentes idades.
Figura 2. Rato estriatal média spiny cultura neuronal utilizando o método de cultura de interface. Neurônios nas imagens estão em DIV 8.
Figura 3. Um rato estriatal meio neurônio espinhoso transfectadas com super eclíptica pHluorin-marcado receptor de dopamina D2 (pH-DRD2). Imagem à esquerda é a projeção de intensidade máxima de uma gravação de lapso de tempo (600 imagens, 100 ms por imagem). Setas brancas indicam a inserção vesicular individual de pH-DRD2. Esta imagem retém informação de inserção na dimensão xy, mas perde a informação da hora. Imagem da direita mostra a intensidade de projecção yt máximo, em que a pilha XYT é girada em 90 graus em torno do eixo y, e o pixel máximo em cada linha do eixo x é projectada para um pixel único eixo y. Esta imagem retém informação de inserção ao longo do eixo yt mas perde a informação eixo x.
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Discussão
Por razões desconhecidas, os neurônios de rato são sempre mais difíceis de cultura do que neurônios de rato. Em nossa experiência, uma cultura mista de neurônios e da glia funciona bem para os neurônios primários de rato cultivadas. No entanto, uma tal cultura mista não é adequado para as experiências de imagiologia TIRF, como neste tipo de cultura de neurónios e seus processos tendem a crescer em cima de células da glia, situando o somata neuronal e processos dendríticos para além do alcance de microscopia TIRF. Assim,...
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado por fundos de inicialização do Laboratório Jackson.
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Materiais
Dulbecco tamponado salino (DPBS)
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do Reagente Empresa Número de catálogo Comentários | |||
| Purificada solução de colágeno bovino (Purecol) | Avançado Biomatrix | 5005-B | |
| Hank solução salina equilibrada (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Penicilina-estreptomicina (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Piruvato de sódio | GIBCO | 11360-070 | |
| Glucose DMEM High | GIBCO | 10313-021 | |
| De soro fetal de bovino (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| Papaína | Worthington Biochemical Corp | LS003126 | |
| Desoxirribonuclease I a partir de pâncreas de bovino (DNase I) | SIGMA | DN25-10mg | |
| GIBCO | 14190-144 | ||
| Tripsina 0,05% | GIBCO | 25300-054 | |
| Poli-L-lisina bromidrato | SIGMA | P2636-1G | |
| Ácido bórico | Fisher-Científico | BP 168-500 | |
| Médio Neurobasal | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Suplemento Serum-Free | GIBCO | 17504-044 | |
| Calor soro de cavalo inativo | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Científico | BP310-500 | |
| Inserir Cultura | Millipore | PICM03050 |
Referências
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Reimpressões e permissões
