Microinjeção insulina hipocampal e<em&gt; Em vivo</em&gt; Microdiálise Durante um teste de memória espacial

Resumo

Modulação da hippocampally dependente de memória espacial de trabalho por microinjeção intrahippocampal direta, acompanhado e seguido por In vivo Microdiálise para metabólitos em conscientes, animais se comportando.

Resumo

O metabolismo da glicose é um marcador útil para a actividade neural local, formando a base de métodos, tais como a imagiologia de ressonância 2-desoxiglicose e magnética funcional. No entanto, o uso de tais métodos em modelos animais e, portanto, requer anestesia ambos altera o estado do cérebro e impede medidas comportamentais. Um método alternativo é a utilização de microdiálise in vivo de tomar a medição contínua da concentração do fluido extracelular do cérebro de glucose, lactato, e afins metabolitos em animais acordados, sem restrições. Esta técnica é especialmente útil quando combinado com as tarefas destinadas a confiar em regiões específicas do cérebro e / ou manipulação farmacológica aguda, por exemplo, as medições do hipocampo durante uma tarefa espacial da memória de trabalho (alternação espontânea) mostram uma queda na glucose extracelular e aumento do lactato que são sugestivo de ^1,2 glicólise aumentada, e administração de insulina intrahippocampal tanto melhora a memória e aumenta glicol hipocampoYsis ^3. Substâncias como a insulina pode ser entregue ao hipocampo através da sonda de microdiálise mesmo utilizado para medir metabolitos. O uso de alternação espontânea, como uma medida da função do hipocampo foi concebido para evitar qualquer confundir motivadores de stress (por exemplo, choque nas patas), de retenção, ou recompensas (por exemplo, comida), todos os quais podem alterar o desempenho de tarefas e metabolismo, o que proporciona também uma tarefa medida da atividade motora que permite o controle de efeitos não específicos de tratamento. Combinados, esses métodos permitem a medição direta das variáveis ​​neuroquímicos e metabólicos que regulam o comportamento.

Protocolo

1. Preparação cirurgia

1. Manipulação. Animais (mais comumente, ratos ou ratinhos, embora o método de microdiálise e em associação com o teste comportamental é em grande parte um problema geral com qualquer requeridos espécies específicas adaptações necessárias, por exemplo para a anestesia) são tratados por um período mínimo de 10 min / dia durante pelo menos dois dias antes da cirurgia. Manipulação extensiva tem sido mostrado para deixar os animais em estado sem tensão no momento do teste, evitando confundir possível ^2,4,5. Nós vamos usar ratos em todo este protocolo como uma espécie de exemplo. O manuseio deve ser feito sem stress causado puxando pele de exemplo luvas de látex ou borracha nitrílica: isto pode ser melhor alcançada usando as mãos, em consulta com o veterinário instalações e funcionários da saúde do empregado. Se isto não for possível, luvas de algodão macio deve ser usado sobre as luvas de barreira para evitar puxar na pele dos ratos.
2. Preparação do campo estéril. Antes de iniciar a cirurgia, o Surgical área é preparada, de um campo estéril preparada em torno do aparelho estereotáxico e uma bata estéril colocado através do aparelho, cobrindo uma placa de aquecimento que é utilizado para manter a temperatura do corpo do rato. Uma almofada de água de circulação quente com termostato preciso é usado para evitar o superaquecimento do animal.
3. Indução da anestesia. O vaporizador de isoflurano é verificado para conter níveis óptimos de isoflurano e ligada à câmara de indução. As conexões são verificados para confirmar um circuito fechado. O sistema de vácuo de tratamento de ar está marcada para ser operacional. Vaporização isoflurano está ligado e o animal posicionado no interior da câmara de indução utilizando um 5% de isoflurano em mistura de oxigénio: ou seja, 5% de isoflurano adicionado numa corrente de oxigénio a 100% e entregue para a câmara de indução.
4. Colocação em aparelho. Os animais são fixados no aparelho estereotáxico usando earbars e uma barra de dentes. Corrigir earbar resultados de colocação em uma cabeça de imóvel e ouvidos que se encontram ao longo das earbars plana. Animaissão rapidamente fixada e o nariz inserida uma finalidade concebido anestésico nosecone; entrega de vaporizado isoflurano é comutada a partir da câmara de indução para o cone do nariz e da mistura do anestésico ajustado para fornecer 2-3% de isoflurano para o fluxo de oxigénio para o cone do nariz indo.
5. Confirmação da anestesia. Um plano anestésico cirúrgico é confirmada através da apresentação de uma pitada rígido para o pé e um sopro de ar para o olho, nem deve provocar qualquer resposta. Estes testes são repetidos a intervalos de aproximadamente 15 min ao longo da cirurgia para confirmar a manutenção de plano anestésico cirúrgico. O cabelo é removido do local da incisão antes de entrar no campo esterilizado.

2. Cirurgia

1. O tratamento inicial dos animais. Pomada oftálmica é aplicada a cada globo ocular para evitar a secagem. 1 ml de solução salina estéril é administrado sc a impedir qualquer desidratação durante a cirurgia, e o corpo é coberto com uma cortina esterilizada. Betadine é aplicado ao couro cabeludo, e esfregada do centrocom um cotonete de algodão; etanol a 70%, é esfregado de forma semelhante, e as duas fases de raspagem são repetidas mais duas vezes para garantir uma incisão adequada. Tempo de contacto com a pele para betadine e álcool deve ser de pelo menos 3 minutos antes da incisão. A anestesia é mantida e controlada regularmente durante toda a cirurgia, com uma única injecção subcutânea de carprofeno 5 g / kg) é administrado para iniciar a analgesia, e uma técnica asséptica é utilizada. Analgesia é dada após a indução da anestesia para minimizar qualquer stress de injeção.
2. Incisão e preparação do crânio. Um corte de 3-4 cm é feita sagitalmente no centro do crânio. Uma mistura de 1:1 de bupivicaine: epinefrina é aplicada topicamente para proporcionar analgesia adicional e minimizar a hemorragia. O couro cabeludo é mantida longe da incisão utilizando grampos cirúrgicos e compressas estéreis são utilizados para remover as membranas sobrepostas do crânio. Coordenadas para perfuração são medidos através de bregma como ponto de referência, marcado usando uma broca estéril (ou, alternativamente, uma mão cautério device), e re-confirmada para a exatidão antes do início da perfuração. Coordenadas para regiões específicas do cérebro de interesse (por exemplo, aqui o hipocampo) são determinados utilizando um atlas cerebral. Para microdiálise hipocampo, usamos um local de perfuração de 5,6 mm posterior ao bregma, 5,0 lateral, e 3,0 ventral da dura.
3. Perfuração. Três buracos são perfurados através do crânio, com o cuidado de aplicar apenas o mínimo de força tal que o trauma para a dura e membranas subjacentes é mínima ou inexistente. Um buraco é medido no local de inserção de uma cânula e os outros dois são posicionadas como conveniente para inserção de parafusos crânio. Propósito de tamanho (por exemplo, parafusos de 1,17 milímetros parafusos auto-roscantes; Science Tools finos) são inseridos nesses orifícios, sem afetar o cérebro por baixo, e são utilizados como pontos de ancoragem para a aplicação subsequente de cimento dentário.
4. Colocação de uma cânula e fecho. A cânula é posicionado na inserção de coordenadas, que são re-confirmado para ser o local do orifício perfurado,e é, então, gradualmente reduzida para a profundidade alvo. Uma vez posicionada adequadamente, a cânula é fixada no lugar com cimento dental. Se necessário, uma sutura cirúrgica estéril único é utilizado para fechar a ferida. Um estilete é inserido para dentro da cânula para manter a desobstrução. Neste protocolo que usar uma sonda CMA12 e guia cânula (CMA microdiálise /).
5. Cuidados pós-cirúrgicos aguda. 3 ml de solução salina estéril é administrado sc para continuar a hidratação, uma única injecção subcutânea de carprofeno 5 g / kg) também é dado início a analgesia. Os animais são retirados do aparelho e colocado numa sala aquecida a recuperação, em uma gaiola limpa e monitorizada até que sejam totalmente recuperado da anestesia. A recuperação total é avaliado pela restauração de corrigir locomoção reflexo e normal. Os animais são, em seguida, voltou para a sua gaiola e sala de realização regular.
6. Curto prazo, cuidados de acompanhamento. Gaiolas de animais que tenham sido submetidos a cirurgia são marcadas com a data da cirurgia. Os animais são monitorados pelo menos uma vez por dia por pelo menos three dias após a cirurgia, e dado um comprimido para mastigar carprofeno (2 mg), no dia após a cirurgia, e cada um dos dois dias seguintes. Se os animais não consomem o carprofeno, carprofeno injectável pode ser administrado para assegurar a analgesia adequada. Monitorar tanto a saúde geral do animal e do estado do local da ferida (por vermelhidão, infecção, etc), seguindo as orientações de cuidados institucionais animais e buscar assistência ou aconselhamento do pessoal cuidados animais ou o veterinário, se necessário. Importante, note que o tratamento adequado e aclimatação ao experimentador é essencial: os animais devem ser manuseados extensivamente, incluindo a manipulação da cânula, até que nenhum sinal de nervosismo ou stress permanece quando manipulado pelo experimentador.
7. Cuidados com os animais e posterior tratamento. Animais seguirá procedimentos adequados de teste e eutanásia de acordo com o protocolo aprovado e seu grupo experimental específico.

3. Microdiálise (MD)

1. PerfusComeram preparação. Fluido extracelular artificial (AECF) é feita com 153,5 mM, 4,3 mM de K, 0,41 mM de Mg, 0,71 mM de Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM de glicose e tamponado a pH 7,4 ⁶ NOTA de que a composição do fluido preciso é essencial:. Imprecisões ou utilizar de outros fluidos fisiológicos, tais como menos de Ringer ou PBS por microdiálise irá resultar em resultados erróneos marcadamente ^6. Especificamente, notar que a composição iónica do fluido extracelular (FEC) não é o mesmo que o do CSF, como se mostrou em um estudo de 2004 detalhada do ECF hipocampal ^6. No dia do teste, albumina de soro bovino (BSA), devem ser adicionados em peso, 2% / peso e completamente dissolvido, o que reduz a perda de péptidos, tais como insulina a partir de aderência ao tubo, e também reduz o risco de perda de fluidos (ultrafiltração) na membrana da sonda. Após a preparação, o perfusado deve ser filtrada através de um filtro de 0,2 | iM.
2. Se um tratamento como a insulina está a ser entregue ao brana região de interesse (aqui, o hipocampo), preparar este tratamento utilizando uma alíquota do AECF preparada com a concentração de droga apropriada. Para a insulina, uma concentração de 400 nM (66,7 mU / uL) para entrega através de microdiálise inverso tem sido demonstrado que afetam metabólica do hipocampo e a função cognitiva ^7. Note-se que a concentração no tecido resultante de insulina não é medida aqui e permanece desconhecida.
3. Configurando sonda mD e linhas. Prepara-se uma sonda de microdiálise fresco e linha do dia antes do teste. Criar duas linhas separadas para "entrada" e "saída". Use PE50 para ligar dois tubos de um metro de comprimento peças de tubagem FEP e assegurar que não é um espaço morto mínimo entre as linhas. Ligue o tubo de entrada para uma seringa Hamilton de 1 mL cheio com esterilizada por filtração e desionizada H ₂ 0 (dH ₂ 0) e, em seguida, juntar à sonda.
4. Giratória microdiálise. Para permitir o movimento de animais livres, enquanto medições, conectar um giro líquido para o inflow e linhas de escoamento, perto da bomba, usando tubos de FEP adicional. Lembrar-se de tomar o volume interno desse tubo giratório e em conta ao considerar temporização da recolha da amostra (em baixo).
5. Configurando bomba mD. Ligue a bomba mD e executar a 1,5 ul / min até ver dH ₂ 0 sair do tubo de saída da sonda. Então, enquanto a bomba está desligada, ligue a outra linha entre o tubo de saída e um tubo de recolha de amostras. Executar 5 ml, através do tubo e colocar a sonda num frasco para injectáveis ​​contendo dH estéril ₂ 0 durante a noite; assegurar que a ponta da sonda permanece sempre molhado.
6. Pré-sondagem cobaia. 24 hr antes do ensaio, remover o estilete manequim da cabeça do rato e inserir uma sonda mD (usado somente para esta finalidade, e não para a recolha de amostras) para 10 min. Em seguida, substitua o estilete manequim e colocar o rato de volta em sua gaiola. Este procedimento foi concebido para minimizar qualquer efeito de gliose reativa no dia do teste ⁸ e nas nossas mãos, o que dá bons results que correspondem aos dados a partir de outras técnicas, e parecem reflectir a activação do hipocampo ^2,5,7,9, outros autores utilizaram uma abordagem semelhante que deixa a sonda no lugar, durante 24 horas antes da medição, o que também é um bom método se danos no sonda durante a noite pode ser evitado.
7. Equilíbrio sonda. No dia de microdiálise, encher a seringa de Hamilton e frasco de cintilação com AECF filtrada e bombear através equilibrar durante 1 hora. Se necessário, encher uma seringa de Hamilton em segundo lugar com o tratamento preparada (por exemplo, a insulina-AECF) e local para dentro da bomba de seringa.
8. Inserção da sonda. Quando o equilíbrio é completa, remova o estilete manequim e suavemente introduzir a sonda mD equilibrada no cérebro do rato através da cânula. Coloque o rato em uma caixa de plástico transparente que contém alguns dos cama do rato casa. Certifique-se de forma a contrabalançar o tubo: anexar um tubo de microcentrífuga de 1,6 ml, cheio com água, para o tubo de fora da gaiola de modo a que a gravidade mantém o microdiANÁLISE linhas unkinked mas não tenso. Deixe sonda equilibrar no rato durante 2 horas. No início deste período, a confirmar que o fluxo de perfusato é desbloqueado: este é feito mais facilmente através da recolha de saída perfusato durante um período definido e pesar a amostra para confirmar que o volume esperado está a sair do sistema. Qualquer sonda que os rendimentos <90% do volume esperado, e não auto-corrigir após remoção e re-inserção, deve ser substituído (caso contrário edema na ponta da sonda irá resultar). Se o fluxo é persistentemente baixo ou ausente, verifique todas as conexões de fugas; sua falta, desligue tubulação em etapas para ver se o bloqueio pode ser isolado. Se o problema não for identificado, substitua a sonda, se o problema não for resolvido, pode ser necessário para começar de novo com nova sonda e linhas de Seção 3.3. O período de equilíbrio de duas horas permite a barreira sangue-cérebro, para selar em torno da sonda e evitar qualquer efeito agudo de inserção da sonda.
9. Coleta de amostras. Garantir que a correlation entre diálise amostra (do cérebro) e coleta (em tubo) é calculado com precisão. Por exemplo, o uso de dois metros de tubo FEP entre giratória e sonda, existe um volume total entre a sonda e recolha de 30 ul e, consequentemente, leva de 20 minutos a 1,5 ul / min velocidade de fluxo para a amostra a passar através das sondas, tubos, conectores e rodar para chegar ao fim do tubo para a coleta. Quando a recolha de amostras garantir que você coletar volume suficiente para ter a concentração necessária para seus ensaios. Aqui, vamos usar 5 caixas de amostra min, e, assim, coletar 7,5 ul de dialisado em cada tubo de coleta.
10. Amostras da linha de base. Uma vez que o equilíbrio é completa, iniciar a coleta de amostra. Recolher pelo menos três amostras enquanto o rato se encontra em repouso na câmara de repouso para estabelecer uma linha de base estável de medições
11. Tempo de tratamento. Tome cuidado para calcular tempo necessário para o início do tratamento antes do experimento: lembre-se que, assim como há uma defasagem de tempo entre a diálisee colheita de amostras, existe um atraso (geralmente idêntico) entre perfusato deixando a seringa até à chegada ao hipocampo do animal. Portanto, na nossa configuração com um volume de 30 ul de uma seringa e entre sonda, alterar a seringa que contém o tratamento perfusato-20 min antes do tratamento desejar começar a entrar no hipocampo.
12. Alterando seringas. Um interruptor de líquido podem ser utilizados, se desejado, mas não é necessário: no momento apropriado, basta desligar a linha de entrada de ar da seringa controle perfusato-se rapidamente e conectar-se ao tratamento de perfusato seringa. Isso não deve demorar mais de 5 segundos para evitar a interrupção significativa para o fluxo perfusato. Note que este processo deve ser revertida após a dose desejada tenha sido entregue, se uma entrega limitada no tempo do tratamento é desejado. Alternativamente, o tratamento pode continuar durante todo o período de amostragem (ver Figura 2). As bolhas de ar não deve ser introduzido na linha durante a comutação deseringas, uma vez que podem acumular-se na membrana de diálise e reduzir a eficiência de detecção.
13. Testes comportamentais. Se estiver executando uma tarefa comportamental, siga esse procedimento (ver secção 4). NOTA de que a coordenação com a entrega de tratamento para o hipocampo é importante. Por exemplo, a entrega de insulina deve ser programada para ocorrer 10 min antes do ensaio começar ^10. Assim, a mudança para um perfusato contendo insulina deve ocorrer 30 min antes do teste comportamental (20 min para perfusato para passar através das linhas mais 10 min de tempo de entrega desejado antes do teste).
14. Conclusão da coleta. Depois de recolher as amostras desejadas, retire a sonda da cabeça do animal, novamente lembrando-se de levar em conta o tempo de atraso entre diálise e coleta de amostras. Retornar o animal à sua gaiola e observar de perto para qualquer modificação pós-experimental de saúde ou de comportamento até que o animal foi morto e o cérebro removido para confirmar correctacolocação da sonda. Se o sacrifício não ocorrer imediatamente, colocar o estilete manequim para a cânula para evitar a introdução de materiais estranhos.
15. Análise. A metodologia analítica irá variar dependendo do analito (s) de interesse. Porque a amostragem de diálise não permite o equilíbrio completo analito na membrana da sonda, as concentrações das amostras devem ser corrigidos para dar as concentrações de FEC usando o método de zero-net-flux ^11,12.

4. Teste Comportamental

1. O posicionamento no labirinto. Após as amostras de linha de base (isto é, depois de pelo menos três amostras de ter completado a diálise, mas pode ainda estar na tubagem de saída a ser recolhida), gentilmente mover o rato para o aparelho de teste comportamental. Qualquer tarefa adequada, podem ser utilizados, os dados da Figura 1, foram obtidos utilizando um de quatro braços em forma de labirinto em cruz elevado e medindo alternação espontânea, o que é uma medida da memória de trabalho espacial: a ratazana é colocada inicialmente no center do labirinto e deixada a explorar livremente ^9,13. Porque qualquer teste comportamental pode ser utilizado, o foco deste protocolo não está na tarefa específica utilizada aqui como um exemplo (que está detalhado em outra parte ^9,14,15), mas em breve, animais se podem explorar o labirinto (o período de a caixa cinza na Figura 1) e utilizar hippocampally processos dependentes para reter a memória do que os braços foram recentemente visitados.
2. Movimento de diálise tubulação durante os testes. Segurar o tubo de tal forma que se move livremente, nem dificultar o movimento do rato nem de ser autorizado a mover-se em frente do animal e distrair-lo. Permanecer no local e minimizar o seu próprio movimento, de modo que você não afetam o comportamento do rato.
3. Coleta contínua. Como durante base, mova o tubo de saída para um tubo de nova coleção a cada 5 minutos.
4. Testes de alternância. Permitir que o animal a explorar livremente o labirinto durante 20 minutos. Registre a sequência e tempo de entradas nos braços ou usandouma gravação de vídeo ou à mão, para posterior análise tarefa desempenho ^9,15.

5. Pós-teste

1. Coleta de amostra final. Após o teste, remova gentilmente rato de labirinto e retorno para controlar câmara. Continuar coleta microdiálise por pelo menos quatro amostras para cobrir o período de recuperação do desempenho da tarefa.
2. Remoção da sonda. Depois de todas as amostras foram coletadas, retire a sonda da cabeça do animal e coloque em um frasco de armazenamento; devolver o animal para a sua gaiola.
3. Armazenamento sonda. Depois de voltar animal da gaiola e completando cobrança de qualquer dialisado restante, lavar a sonda cuidadosamente com dH ₂ 0 e armazenar em um frasco de cintilação preenchido com dH ₂ 0 e coberto com parafilme. Lavar os tubos de comutação a uma seringa que contém uma solução de 1:10.000 Kathon em dH ₂ 0 para evitar o crescimento microbiano. As sondas podem ser re-utilizados, desde que eles mantêm bom fluxo e têmnenhum dano para a membrana; com cuidado este deve ser rotineiramente em excesso de 10 utilizações.
4. Histologia. Matar o animal e remover o cérebro. Fatia em um criostato e usar o padrão de técnicas histológicas (coloração violeta cresil por exemplo) para confirmar a colocação correta da sonda.

Resultados

Ratos deve se recuperar rapidamente de cirurgia e estar alerta, móveis e ativo dentro de 30 minutos após o término da anestesia. O impacto da tampa da cânula deve ser mínima, se a cirurgia for realizada de forma limpa e cimento dental mínima é utilizada. Se qualquer sinal de infecção é observado durante o acompanhamento pós-operatório, ou o rato é de qualquer forma a mostrar sinais de desconforto ou constrangimento, rescindir imediatamente o experimento, o que deve ser extremamente raro. Durante a manipulação, antes do ...

Discussão

Todas as soluções utilizadas no microdiálise deve ser filtrada antes da utilização, utilizando um filtro de 0,2 | iM. Após a inserção da sonda na cânula guia, observar para confirmar que o fluxo é livre e coleta de amostra está ocorrendo. Se o fluxo pára após a inserção, a causa mais provável é a lesão da membrana causada por sonda cuidados insuficientes na inserção, e uma sonda de fresco tem de ser substituído.

Como observado acima, uma vantagem chave para esses métodos é a falta de confund...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			A maioria dos reagentes são de qualidade padrão de laboratório e podem ser obtidos a partir de um fornecedor de escolha. Do mesmo modo, o equipamento tal como bombas de seringa e os tubos podem ser usados ​​a partir de qualquer um dos vários fabricantes. Itens específicos usados ​​aqui para que os detalhes são importantes incluem:
CMA 12 sondas de microdiálise	CMA microdiálise /	CMA-12-XXX	Estes estão disponíveis em vários comprimentos de membrana e cortes, indicados por códigos específicos no 'XXX.
Insulina humana (Humulin)	Eli Lilly	N / a
Giratória líquido	Instech	375/D/22QM	Isto tem o torque rotativo específico muito baixo e o volume interno, bem como um nonrearevestimento de quartzo ctive.