Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

Stephan Heermann; Kerstin Krieglstein

doi:10.3791/50016

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Analisando o desenvolvimento de células de Schwann Murino Junto axônios em crescimento

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DOI:

10.3791/50016

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21 de novembro de 2012

Stephan Heermann¹^,² , Kerstin Krieglstein¹^,³

¹Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , ²Department of Neuroanatomy, University of Heidelberg, ³FRIAS, University of Freiburg

Neste artigo

Resumo

Aqui descrevemos uma célula de Schwann (SC) ensaio de migração em que SCs são capazes de desenvolver ao longo dos axônios estendem.

Resumo

O desenvolvimento de nervos periféricos é um processo intrigante. Neurônios enviam axônios para inervar alvos específicos, que nos seres humanos muitas vezes são mais de 100 cm de distância da soma do neurônio. A sobrevivência neuronal durante o desenvolvimento depende de factores de crescimento derivados alvo, mas também com o apoio de células de Schwann (SC). Para este fim os axônios ensheath SC a partir da região da soma neuronal (ou a transição da central para o sistema nervoso periférico) para a sinapse ou junção neuromuscular. As células de Schwann são derivados da crista neural e migram ao longo de axónios como precursores emergentes até o axónio inteiro é coberto com SCs. Isto demonstra a importância do SC de migração para o desenvolvimento do sistema nervoso periférico e sublinha a necessidade de investigar este processo. A fim de analisar SC desenvolvimento, uma configuração é necessário que ao lado das SCs também inclui seu substrato fisiológico para a migração, o axônio. Devido ao desenvolvimento intra-uterino (Mus musculus). Para contornar isso, adaptamos o gânglio cervical superior técnica de explante (SCG). Após tratamento com factor de crescimento do nervo (NGF) explantes SCG estendem axónios, seguido de precursores SC migram ao longo dos axónios do gânglio para a periferia. A beleza deste sistema é que o SC são derivados a partir de um pool de SC endógena e que migram ao longo das suas próprias axônios fisiológicos que estão a crescer, ao mesmo tempo. Este sistema é especialmente interessante, porque o desenvolvimento ao longo SC axónios podem ser analisados por lapso de tempo de imagem, abrindo novas possibilidades para obter insights sobre migração SC.

Protocolo

1. Preparação de géis de colagénio

Prepara-se uma média de valores, contendo 455 ul de MEM de 10x, 112 ul de 7,5% de NaHCO _3, 50 ul de glutamina e NaOH. A concentração e a quantidade de NaOH depende da preparação de colagénio da cauda de rato (ver 1.2), o volume final do meio de estoque sendo 1000 ul.
Prepare-colagénio da cauda de rato de acordo com Ebendal (1). Armazene a solução de colagénio, a 4 ° C. A degradação da solução de colagénio não pôde ser observado. Após a preparação de um novo lote, estimar a concentração de NaOH necessária para o meio de stock (ver 1.1). Utilizar o indicador de pH do meio para a titulação da quantidade e da concentração de NaOH. 800 ul colágeno rato-cauda ácida tem que virar um tom de vermelho quando misturado com 210 ul do meio de ações. Se a concentração de NaOH é muito baixa a solução de colagénio ficará amarela, devido a que o indicador de pH do meio. Adicione o colágeno para o meio e misture sem producing bolhas. Execute essas etapas em gelo. A polimerização ocorre dentro de 2 horas após a solução de colagénio e o meio de estoque foram misturados e a nova solução é incubada a 37 ° C. Testar isso antes de iniciar um experimento. 1.3) Misture 800 ml de solução de colágeno com 210 ul de meio de ações (ver 1.2). Coloque 100 ul desta solução nos poços de uma lâmina de câmara 8 também. Incubar as lâminas a 37 ° C, 5% de CO ₂ e de condições de humidade numa incubadora de cultura de células. Preparar os géis de colagénio em um banco de cultura de células e condições estéreis. O colagénio é gelatinizado dentro de 2 horas.

2. Dissecação de SCGs embrionárias

Colheita de embriões em tempo ratas grávidas (E16-18) do útero e mantê-los em PBS até mais necessário.
Dissecar um embrião a partir do âmnio. Decapitar o caudal embrião do nível clavicular. Fixe a cabeça em um prato fundo de silício com "inseto-agulhas". O lado ventral da cabeça tem de enfrentar a você umaD Você tem que ver a região submandibular. A fixação permite a fácil preparação.
Remova a pele da região submandibular esquerda e para a direita e com ele o tecido conjuntivo sub-cutânea.
Retire as glândulas salivares submandibulares de sua localização para limpar a vista para o hióide, os músculos infrahyoidal eo músculo esternocleidomastóideo.
Remova os músculos cuidadosamente para limpar a vista para a laringe ea traquéia. Remover a traqueia e laringe. As artérias carótidas são, então, visível em ambos os lados sobre os músculos pré-vertebrais. O GCS está localizado na bifurcação das artérias carótidas e tem uma forma oval. Remova cuidadosamente os gânglios e colocá-los em PBS. Remover os gânglios suavemente a partir das ferramentas de dissecação, se forem aderindo a elas. É vantajoso usar uma pinça, bem como um porta-agulhas montado com uma "agulha de insectos" para a remoção do SCG.
Uma vez em PBS, armazenar os gânglios à temperatura ambiente em PBS até dissecados enougânglios gh. Em seguida, limpe os gânglios dos vasos sanguíneos e tecido conjuntivo. Realizar a dissecção SCG e limpeza sob um microscópio de dissecação colocado debaixo de um banco de fluxo laminar.
Finalmente, coloque os gânglios explantados para os géis de colagénio gelatinizadas com a ajuda de agulhas de seringa montado em uma seringa para uma manipulação mais fácil.
Incubar os explantes SCG sobre o colagénio gelatinizado numa incubadora de cultura de células a 37 ° C, com as condições de _5% de CO2 e humidade.

3. Tratamento de Explantes SCG

Após 1-2 horas de incubação, cobrir o colagénio explante SCG contendo meio de cultura com 100 uL contendo Neurobasal célula B27 suplemento, glutamina e antibióticos. Agora, os poços das lâminas de câmara conter um volume de 200 ul (100 e 100 ul de gel ul de meio). Adicione outro ul 200 do meio, no entanto agora contendo NGF (60 ng / ml) para facilitar o crescimento axonal. Por conseguinte, a concentração final de NGF é de 30 ng / ml.
1. Para investigar o aparecimento de SC migração, adicione fatores adicionais diretamente no dia in vitro 0 (DIV0). Dissolver os fatores do meio de NGF contendo em o dobro da concentração necessária (2).
2. A fim de analisar o impacto no SCS, que já começaram a migrar ao longo de axônios, adicione fatores adicionais a DIV3 até DIV4 (paragem potencial do experimento). Para este fim, retirar cuidadosamente 180 ul da solução, em DIV3, e adiciona-se 200 ul de meio novo NGF contendo e os factores adicionais de interesse na concentração dupla (2).

4. Lapso de tempo de imagem

Use um microscópio invertido para análises. Diferentes objectivos podem ser usados, que define o campo de visão e ampliação. Um aspecto importante, contudo, é a distância de trabalho do objectivo utilizado, como imagens dos explantes SCG é realizada por meio da lâmina de vidro e o colagéniogel. A taxa de quadros de gravação de 1/10-30 minutos, mostrou bons resultados (2). No entanto, este aspecto tem de ser ajustado para a questão científica. Uma câmara CCD normal pode ser utilizado para a obtenção da imagem. Para imagiologia de lapso de tempo de uma câmara de incubação de células de cultura tem que ser ligado à fase do microscópio. Incubar o tecido durante a imagiologia, a 37 ° C, com as condições de _5% de CO2 e humidade. Inicie a incubação de uma hora antes do início do sistema de geração de imagens. Isto permite que as partes do microscópio (por exemplo, objectivo), incluindo a câmara de corrediça para ajustar a temperatura e evita desvios de temperatura induzidas. Definir as áreas específicas de análises (dentro de explante e entre diferentes explantes) com a ajuda do software de microscópio e uma fase motorizada controlada por software (configuração multiposições) para análises simultâneas de diferentes condições aplicadas aos explantes SCG. Por lapso de tempo tecidual de tipo selvagem, bem como nos tecidos dos animais transgénicos pode ser usadomarcando o SCs (S100B: GFP) (3). Para fluoróforos de imagem de uma fonte de luz fluorescente deve ser implementado na configuração micropscope. Use filtros padrão.

5. Quantificação das distâncias de migração SC

No ponto final (DIV4 por exemplo), corrigir os géis de colágeno com PFA 4% no slide câmara para 3-4 horas. Consecutivamente, os géis de colagénio lavar 5 vezes durante 10 min com PBS. Aplicar protocolos padrão para a imunocitoquímica (2). Se você é novo para a preparação de SCGs, verificar a identidade do gânglio como um gânglio simpático por imuno-histoquímica contra tirosina hidroxilase (TH) um marcador comum para células catecolaminérgicos. Durante imunohistoquímica (após o anticorpo primário), transferir os explantes géis de colagénio contendo a placas de 24 poços, os quais têm um volume maior, o que é benéfico para a lavagem do gel.
Depois de imuno-histoquímica, coloque cuidadosamente o gel de colágeno em lâminas de vidro. Cuidadosamenteremover a solução restante e deixe secar o colágeno / encolher a duas dimensões. Isso permite que as medições fáceis de distâncias (2). Depois disso, montar as amostras.
Finalmente, medir distâncias de migração com a ajuda de software Fiji (NIH). Não plugins especiais são necessários para esse fim. Para permitir que medidas corretas em um, verificar os metadados de imagem correta e as configurações no Fiji, imagem e escala. Use Fiji também para a quantificação das células.