Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

Wen-Chi Chen; Sung-Hyun Park; Carol Hoffman; Cecil Philip; Linda Robinson; James West; Gabriele Grunig

doi:10.3791/50023

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Artigo de método

Sistólica do ventrículo direito Medição de Pressão em combinação com colheita de amostras de tecido pulmonar e imunológica em ratos

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DOI:

10.3791/50023

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16 de janeiro de 2013

Wen-Chi Chen^*¹ , Sung-Hyun Park^*¹ , Carol Hoffman¹ , Cecil Philip¹ , Linda Robinson² , James West² , Gabriele Grunig¹^,³

¹Department of Environmental Medicine, New York University School of Medicine, Tuxedo, ²Division of Allergy, Pulmonary, & Critical Care Medicine, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, ³Division of Pulmonary Medicine, New York University School of Medicine

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um protocolo específico e rápido para pesquisar, simultaneamente, a função cardíaca direita, inflamação pulmonar, e da resposta imunológica é descrito como uma ferramenta de aprendizagem. Vídeo e figuras descrevem fisiologia e técnicas de microdissecção em um grupo organizado abordagem, que é adaptável a ser utilizado para as pequenas e grandes estudos porte.

Resumo

A função do coração é bombear direito o sangue através dos pulmões, que liga a fisiologia do coração direito e fisiologia vascular pulmonar. A inflamação é um modificador comum do coração e da função do pulmão, através da elaboração de infiltrado celular, produção de citocinas e factores de crescimento, e, iniciando processos de remodelação ^1.

Em comparação com o ventrículo esquerdo, o ventrículo direito é uma bomba de baixa pressão, que funciona de uma zona relativamente estreita de mudanças de pressão. O aumento das pressões de artéria pulmonar estão associados com aumento da pressão no leito vascular pulmonar e hipertensão pulmonar ^2. A hipertensão pulmonar é frequentemente associada a doenças pulmonares inflamatórias, por exemplo, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças auto-imunes ou ^3. Como a hipertensão pulmonar confere um prognóstico ruim para a qualidade de vida ea expectativa de vida, muita pesquisa é direcionada para a compreensão dos mecanismos que might ser alvos para ⁴ intervenção farmacêutica. O principal desafio para o desenvolvimento de ferramentas de gestão eficazes para a hipertensão pulmonar permanece a complexidade da compreensão simultânea de alterações moleculares e celulares no coração direito, os pulmões eo sistema imunológico.

Aqui, nós apresentamos um fluxo de trabalho de procedimento para a medição rápida e precisa de mudanças de pressão no coração direito de ratos e a colheita de amostras em simultâneo a partir de coração, pulmões e tecidos imunes. O método baseia-se no cateterismo directa do ventrículo direito através da veia jugular em estreita de peito ratinhos, desenvolvido pela primeira vez na década de 1990, como medida substituta da pressão na artéria pulmonar ^5-13. A equipe de abordagem organizada facilita muito rápida técnica de cateterismo do coração direito. Isto faz com que seja possível realizar as medições em ratos que respiram espontaneamente com ar ambiente. A organização do fluxo de trabalho em diferentes áreas de trabalho-reduz o tempo de atraso e abre a possibilidade de realizar simultaneamente experimentos de fisiologia e colher tecidos do coração, pulmão e imune.

O fluxo de trabalho de processo descrito aqui pode ser adaptado para uma grande variedade de ambientes de laboratório e desenhos de estudo, desde pequenas experiências orientadas, para testes de rastreio grandes drogas. A aquisição simultânea de dados da fisiologia cardíaca que pode ser expandida para incluir a ecocardiografia ^5,14-17 e colheita de tecidos de pulmão, coração e imunológico, reduz o número de animais necessários para obter os dados que se movem a partir do conhecimento científico para a frente. O fluxo de trabalho processual apresentada aqui também fornece uma base ideal para ganhar o conhecimento das redes de ligação de pulmão, imune e função cardíaca. Os mesmos princípios aqui descritos podem ser adaptados para estudar outros órgãos ou adicionais, se necessário.

Protocolo

1. Preparação

Preparar as seguintes soluções e tubos (Tabela 1) como se segue:
1. Hanks, solução sem cálcio e magnésio, ou com o indicador de penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / ml).
2. Salina tamponada com fosfato (PBS), 1x, sem cálcio, nenhum magnésio.
3. Etanol, 70%, perfazer 500 ml.
4. Formol tamponado, 7-10% com PBS, perfazer 500 ml.
5. Anestesia soluções:
  1. Avertin. Adiciona-se cuidadosamente 5 ml de 2-metil-2-butanol a 5 g de 2,2,2-tribromoetanol. Uma vez dissolvido, mantenha solução estoque, à temperatura ambiente, no escuro. Tomar 0,25 ml da solução-mãe e diluir com 10 ml de 1xPBS em frasco com fundo de vidro. Enrole a garrafa com folha de alumínio, lugar a 37 ° C até se dissolver e depois aliquota em 5 ml de tubos de polipropileno e manter no refrigerador. Aquecer uma alíquota, na manhã da experiência.
  2. Barbitúricos. Diluir solução-mãe com PBS para dar origem a 2,6% barbitúrico solution. Colocar alíquotas de 3-4 ml em tubos de polipropileno.
Organizar três trabalhos-áreas (Figura 1).
1. Área A: Organizar os seguintes itens: a forma de estudo para registrar o número de estudo de identificação, data, peso corporal, peso de coração direito, coração esquerdo e septo, balança de precisão (0-50 g de precisão de 0,01 g) para determinar o peso corporal; escala micro para determinar peso do coração em 0,001 g de precisão; pesar barcos; anestesia soluções (claramente marcado); dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa para coletar sangue e amostras de tecidos (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos ( A Tabela 2, Figura 2), e as soluções para limpar os instrumentos (Tabela 1).
2. Área B: Preparar os seguintes itens: microscópio de dissecação, cateter ventricular direita ligada a uma unidade de controlo de pressão que está conectado a um amplificador e um computador portátil. O cateter é colocadoum copo contendo água. Organizar instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), pedaços de corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; fita (fita de autoclave é ótima) cortados em comprimento e largura ideal e alinhados no banco ou microscópio de laboratório para o acesso fácil, cotonetes e solução de removedor de pêlos. Calibra-se o cateter no início do estudo.
3. Área C: Organizar os seguintes itens: lupa; cânula traqueal; seringas de 1 ml; corte de sutura para tamanho ideal e colocado em um barco pesar; dewar pequena com nitrogênio líquido; recipiente isolado com gelo, tubos e 24-bem placa de recolher BAL e amostras de tecido (Tabela 1), instrumentos cirúrgicos (Tabela 2), soluções para realizar BAL e para limpar a cânula traqueal e os instrumentos (Tabela 1).

2. Cateterismo Cardíaco Direito

Pesar mouse usando uma balança de precisão delicadamente colocando o mouse em um pesar baveia. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente. Grave peso. O protocolo descrito funciona melhor para ratinhos que são de 20 g ou mais, porque o diâmetro da veia jugular tem de acomodar o cateter de pressão, é possível a cateterização ratos pequenos (17 g ou mais), enquanto a veia é suficientemente grande.
Anestesiar o rato por injecção com Avertin, dependendo do peso corporal (10 ul / g), por exemplo, para dar 20 g 200 ul, para dar 25 g 250 ul, para dar 30 g 300 ml. O volume de injecção exacta tem de ser ajustado, dependendo da estirpe do rato. Certifique-se de lidar com o animal suavemente e silenciosamente porque o estresse pode alterar a resposta ao anestésico.
Uma vez que o mouse é sedado lugar, em duplo papel de seda plissada. Note o número de identificação do artigo. Suavemente esfregue loção depilação no aspecto ventral do pescoço para limpar o campo cirúrgico. Posicione o mouse de volta para o papel e esperar por 1-2 min.
Remover os pêlos da face ventralno pescoço, acariciando o cabelo contra o sentido do crescimento do cabelo com cotonetes.
Cuidadosamente determinar a profundidade suficiente de anestesia, verificando a ausência do reflexo de pés: o mouse não reagir a beliscar de seus dedos.
Trabalhando rapidamente e descontraído, o restante do cateterismo cardíaco direito não deve levar mais de 10 minutos, de forma otimizada 3-6 min. É importante que o tecido não seca, porque o catéter tem de deslizar para dentro da veia e mover-se para dentro da veia em uma camada de humidade. Tempo consistente do processo é importante para a geração de dados que são comparáveis entre os dois grupos.
Voltar lugar do mouse em papel de seda e de transferência com papel de seda em isopor bordo. Corrigir as patas ea cabeça no lugar usando fita autoclave.
Faça uma incisão de pele de mandíbulas para esterno (osso do peito).
Dissecar cuidadosamente para cima da tireóide grandes para as mandíbulas para expor a veia jugular direita umª traquéia.
Lugar de isopor placa segurando o mouse sob o microscópio de dissecção com o plano de foco já está em vigor e as lentes em aproximadamente 0,8 x ampliação (ampliação total [lente ocular x] é de cerca de 8x.
Microdissect cuidadosamente da veia jugular direita, removendo circundante tecido conjuntivo com pinça cirúrgica.
Colocar duas partes de fio de sutura na parte superior da veia jugular direita. Atar o fio de sutura mais próximo das mandíbulas para fechar o fluxo de sangue na veia de um fio pequeno, colocar o fio de sutura que está mais próxima do esterno / esterno em um nó frouxo em torno da veia. Pode-se usar as gotas pequenas de sangue para posterior encontrar o furo na veia, caso seja necessário.
Respire e relaxe (soltar os músculos do pescoço e da mandíbula) para manter seus olhos na veia através da ocular. Isso irá garantir que suas mãos e dedos vai passar de forma segura, suave e relaxante. Enquanto mantém a veia com uma pinça no lado mais próximoas mandíbulas, um furo na veia entre as duas suturas usando micro-tesoura operados por outro lado. Coloque as tesouras micro-, e manter essa relaxada mão, sentir o cateter. Suavemente recuperar o cateter segurando-o entre o polegar eo dedo indicador (Figura 3). Introduzir o cateter no orifício da veia.
Suavemente avançar o cateter no interior do coração direito (Figura 3). Observar as marcas no cateter que dão um índice aproximado de quão longe o catéter tem de ser inserida e observar o monitor. Uma vez que as curvas de pressão são apresentados, apertar ligeiramente inferior a sutura em torno do cateter. Uma vez que o cateter tem uma resistência à tracção que lhe confere uma bobina, e porque a batida do coração e de respiração do rato adicionar movimento, adicionalmente fixar o cateter com fita.
Grave medições de pressão, durante 2 minutos para análise posterior (Figura 4).
Abrir o suporte da sutura do cateter e então suavemente retrieve cateter. Limpar a parte de trás do transdutor de pressão, local de volta para o recipiente com água. Não toque no transdutor de pressão.
Transferir o rato em cima do papel de tecido para a área A para a eutanásia, a recolha de sangue e tecido do baço. Limpar instrumentos cirúrgicos.
Iniciar o procedimento com o próximo animal. Quando o tempo permite, injetar o anestésico enquanto espera para gravar a curva de pressão (2,15).

3. Coleta de amostras de sangue e Baço

Injectar solução barbitúricos, 400 ul por rato e espere por 1-2 min. Isto é realizado rotineiramente no nosso laboratório a fim de evitar a possibilidade de que, inadvertidamente, os ratos recuperar da anestesia, enquanto avertina-de sangrado. Normalização adequada do experimento é conseguido através da injecção da mesma dose de solução de barbiturato por rato, e pela espera a mesma quantidade de tempo antes da colheita de sangue. Se for permitido pelo Animal Care Institucional e Comitê Use econtanto que os animais são cuidadosamente monitorizados quanto a profundidade da anestesia antes da sangria, esta etapa pode ser omitida.
Faça uma incisão no abdômen. Abrir a veia caudal (veia cava), e colheita de sangue utilizando uma pipeta de transferência.
Remover o baço, ou uma parte do baço para dentro do tubo de Eppendorf e congelamento em azoto líquido, pressão, ou para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem para a preparação posterior de células individuais.
Transferir o rato em cima do papel de seda a área de trabalho-C para a recolha de BAL, o nodo de drenagem linfática de pulmão, pulmão, e os tecidos do coração. Limpar instrumentos cirúrgicos.

4. Recolha de amostras de pulmão e do coração

Dissecar o livre traquéia de músculo e tecido conjuntivo. Fórceps colocação sob a traquéia, puxe através de sutura. Gentilmente gerar trecho suficiente para cortar um buraco. Manter o alongamento suave, inserir a cânula traqueal com um movimento ligeiramente girando, e sutura cânula intó lugar. Para a inserção da cânula traqueal, certifique-se de que a traqueia seja húmido, se necessário adicionar uma gota de solução de Hanks. Durante todo o processo, respirar, relaxar músculos do pescoço e da mandíbula, para manter os movimentos da mão segura e suave.
Dissecar abrir a caixa torácica, removendo cuidadosamente o esterno a partir da extremidade abdominal. Não perturbe o conteúdo do tórax, porque isso irá torná-lo muito difícil encontrar o nó de linfa.
Realizar lavado broncoalveolar (LBA) por inserção suavemente 1 ml de tampão de Hanks, vire suavemente a seringa e recuperar fluidos BAL. Repetir 3 vezes, o tubo estreito e colocar em gelo. Durante todo o processo, manter os olhos na extremidade da cânula traqueal que se conecta à seringa. Olhar para observar o tórax inflação e deflação dos pulmões.
Colheita linfonodo pulmão mantendo parede costelas com um conjunto de pinças, encontrar e recuperar o nó de linfa com outros fórceps. Nó de linfa lugar em 24 placa bem. É importante kagora onde procurar: a partir do pescoço, encontrar a entrada da caixa torácica a partir do lado direito do rato e olhar por cima da coluna (Figura 5).
Colheita coração e coloque em papel de seda. Isolar o coração direito, cuidadosamente dissecar ao lado do septo. Transferência para área de trabalho-A pesar, registrar o peso e colocar nos tubos de eppendorf para tirar congelamento em nitrogênio líquido.
Coloque sutura em torno do lobo do pulmão esquerdo para fechar o brônquio principal. Dissecar o pulmão esquerdo lobo livre, em lugar do tubo eppendorf e congelamento de encaixe em azoto líquido, ou local dentro de um poço de uma placa de 24 poços contendo uma solução de Hanks para o isolamento posterior de suspensões de células individuais.
Insira aprox. 0,5 ml solução de formol tamponado através da cânula traqueal para os lobos pulmonares restantes. Depois de inflação, dissecar os lobos pulmonares para fora do tórax e coloque em tubo de 50 ml contendo solução de formaldeído. Para um projeto de estudo alternativo, os pulmões podem ser inflados com otimismomal meios de corte (OCT, diluído a 1:4 com PBS) e congelados em um molde contendo outubro não diluídas para a preparação posterior de secções congeladas. Outro projeto de estudo pode exigir a obtenção de pressão tecido pulmonar congelado e suspensões de células individuais dos pulmões. Nesse caso, não é necessária a inflação: dissecar os lobos pulmonares restantes; recuperá-los a partir do tórax e do lugar para a placa de 24 poços para um tampão de Hanks contendo bem.
Remover cânula traqueal, limpo por lavagem com tampão de Hanks, limpar instrumentos cirúrgicos.

5. Análise de curvas de pressão gerada a partir do cateter do coração direito

Os gravados dados de pressão do ventrículo direito são analisados usando LabChart 7 software sem conhecimento da identidade de grupo de cada gravação. Mais de 20 curvas são seleccionados de forma aleatória e que a diferença entre máximo e mínimo de pressão ventricular medido para cada curva (AP). O AP média é calculada para dar o v direitapressão sistólica entricular.