Summary
Мы представляем способ создания разреженных черепа корковых окна (TSCW) в мышиной модели
Abstract
Оптический когерентной томографии (ОКТ) является биомедицинская техника визуализации с высоким пространственно-временным разрешением. С его минимально инвазивных подход октября широко используется в офтальмологии, дерматологии, гастроэнтерологии и 1-3. Использование разреженных черепа корковых окна (TSCW), мы используем спектральной области OCT (SD-OCT) модальность в качестве инструмента для изображения коры в естественных условиях. Как правило, открыты, череп был использован для нейро-визуализации, поскольку он обеспечивает большую гибкость, однако, подход TSCW является менее инвазивной и является эффективным средством для долгосрочного видения в невропатологии исследований. Здесь мы представляем метод создания TSCW в мышиной модели в естественных октября визуализации головного мозга.
Introduction
С момента своего появления в начале 1990-х годов, OCT широко используется для визуализации биологических структур тканей и функции 2. Октябрь генерирует изображения поперечного сечения путем измерения времени задержки эхо-сигнала обратного рассеяния 4 световых путем осуществления источник света низкого согласования с волоконно-оптическим интерферометра Майкельсона 2,4. SD-OCT, также известный как фурье домена октября (FD-октябрь), был впервые представлен в 1995 5 и предлагает превосходный механизм визуализации по сравнению с традиционной временной области OCT (TD-октябрь). В SD-OCT, ссылка рукой держится стационарных приводит к высокой скоростью и сверхвысоким разрешением изображения приобретении 6-9.
В настоящее время TSCW модели были использованы в значительной степени в естественных изображений мозга применения двухфотонной микроскопии в места традиционного трепанации черепа. Эти TSCW были использованы одновременно с пользовательской пластины черепа или скольжения стеклянной крышкой 10-13 предоставить дополнительные IMAненности ВИЧ варьируется стабильности. В наших исследованиях мы обнаружили, что такие аксессуары, как они не являются необходимыми для визуализации октября, когда TSCW используется. Таким образом, отсутствие пластины черепа или скользит стеклянная крышка позволяет широкий диапазон изображений размер окна, как они могут влиять на оптический луч и изменять октября изображений.
Разреженных черепа подготовка оказалась выгодной в визуализации исследования мозга с помощью двух-фотонной микроскопии 10-13. В наших экспериментах мы используем SD-OCT системы изображение коры в естественных условиях через TSCW. Наши пользовательские SD-OCT изображений установки содержит широкополосной связи, низкокогерентной источник света, состоящий из двух суперлюминесцентных диодов (СЛД) с центром в 1295 нм с полосой пропускания 97 нм в результате осевой и боковой резолюцией 8 мкм и 20 мкм, соответственно 14 . С нашей оптических устройств обработки изображений, мы предполагаем, что изображение через TSCW имеет большой потенциал в выявлении и визуализации структуры и функции в оptically плотные ткани головного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Хирургическая подготовка
- Женский CD 1 мышей в возрасте от 6-8 недель были использованы в наших экспериментах.
- Anesthetize мыши с внутрибрюшинного введения кетамина и ксилазина комбинации (80 мг / кг ketamine/10 мг / кг ксилазина). Наведите на теплокровного площадку, чтобы обеспечить оптимальную температуру тела на ~ 37 ° C. Постоянно контролировать уровень анестезии, проверяя рефлексы животного (например, зажимая ногу с тупым пинцетом) и придать более анестезии при необходимости.
- Смажьте оба глаза с искусственным мазь слезу. Удалить волосы на голове помощью бритвы и удалить остатки волос с использованием 70% спирта колодки преп. Нанесите тонкий слой Nair крем удаления волос на кожу головы и подождать 2 минуты для того, чтобы вступить в силу. Аккуратно вытереть Наир и оставшихся волос с помощью смоченной солевым ватные тампоны и прокладки алкоголя преп. Скальп теперь должна быть полностью голые.
- Лечить кожу головы, используя палку бетадин тампон и очистить с 70% этанола колодки преп.
- Аккуратно заверните животное в хирургических простыней, чтобы обеспечить оптимальную температуру тела ~ 37 ° C и смонтировать животных на стереотаксической рамы для иммобилизации черепа. Слегка постучите по черепу, чтобы обеспечить ее стабильность. Список использованных материалов приведены в таблице 1.
2. Разреженных черепа кортикальной Подготовка Window
- Начало разрез по срединной линии точку между глаз. Продолжить каудально к средней линии точки между ушами. Часть кожу щипцами.
- Найдите область, чтобы разбавлять под рассекает микроскопом и аккуратно удалить фасции с помощью пинцета. Высушите череп с стерильных ватных тампонов, прежде чем создавать разбавленной корковых окна. В наших экспериментах, мы создали 4 × 4 мм разбавленной черепно окна ~ 1 мм, задних и боковых брегмы.
- Начало истончение черепа с помощью круглой карбида бора со сверлом размер немного 0,75 мм в хирургическом ручную с помощью света широкие ONL движенияу. Не применять прямое давление на череп. Остановить бурение каждые 20-30 секунд, чтобы удалить пыль с помощью костного стерильного физиологического раствора и ватные тампоны и, чтобы избежать перегрева черепа. Солевой также поможет в рассеивать тепло по всему черепу.
- После того, наружный слой компактной кости полностью удалено середине губчатый слой кости теперь должны быть видны. Там могут быть некоторые незначительные кровотечения, как кровеносные сосуды более заметны в губчатый слой кости. Переключить на зеленой бор камень и продолжать бурение использования дополнительных осторожностью, так как губчатый слой является более деликатным. Зеленый бор камень удалить менее костного материала при создании равномерность по всему черепно окна. Остановить бурение иногда, чтобы удалить пыль и кости, чтобы охладить черепа.
- Наконец, когда череп стал более прозрачным и сосудистую на мозг теперь видно, начинают полировки черепа помощью полировки бора. Это позволит более точно истончение время заглаживания черепа. Проверьте тонкости SKULL, осторожно нажав на нее пинцетом. Остановить полировка когда череп становится немного гибкие.
- Разбавленной черепно окно должно теперь быть совершенно гладкой и отражающей и готова для работы с изображениями (рис. 1). В связи с характером сильно рассеивающих тканей головного мозга, череп должен быть разбавлен по крайней мере 55 мкм для оптимальной глубины проникновения. Список использованных материалов приведены в таблице 1.
3. Оптической когерентной томографии изображений
- После операции завершена, проверить дыхание животного скорость и рефлексы, чтобы обеспечить надлежащий уровень анестезии и управлять дополнительными анестезией, если необходимо. Удалить животное из стереотаксической рамы, держать животных, завернутые в хирургических простыней и транспорта животного к визуализации станции.
- Перед изображениями знаков для проверки рефлексов и применять дополнительные искусственные слезы, если это необходимо. Установите животных на стереотаксической рамы, чтобы обеспечить черепа.
- Место животное подОктябрь камеры и положение TSCW под оптическим лучом (рис. 2). Поперечное сечение черепа и головного мозга теперь могут быть визуализированы (рис. 3).
- Сбор данных может начаться раз прочих интересных находится. Для визуализации целей, мы используем Galvo зеркала для достижения изображение окна с шириной 4,0 мм. Визуализации глубину 2 мм был получен с 6 мВт мощности падающего и координационного центра 1 мм ниже разбавленной черепа. Каждый площадь поперечного сечения состоял из 2048 осевое сканирование с приобретением скоростью 0,14 сек на изображение.
- Объемное сканирование мозга также могут быть получены путем сбора ряд 2D-изображения поперечного сечения, используя два набора зеркал Galvo для ху сканирование с первого зеркала Galvo сканированием луча в сагиттальном направлении, а второе зеркало Galvo сканирование в корональной направлении.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После создания разбавленной окна по коре головного мозга сосудистой теперь должен быть визуально более видное (рис. 1) и позволит более глубокие глубины визуализации (до 1 мм). Право коры сокращается до примерно 55 мкм по сравнению с нормальным черепом оцениваются по 140 мкм (рис. 1) и обеспечивает большую оптическую прозрачность. Далее прореживания до 10-15 мкм возможно 11, однако нет необходимости, поскольку использование стеклянной крышкой промахи и черепа пластинами не реализованы в наших экспериментах (рис. 1 и 2). Данный метод позволил нам выявить конкретные структуры (кора головного мозга, мозолистого тела) в нашей октябре изображения поперечного сечения (рис. 3). Парасагиттальных октября изображений нормальные черепа (рис. 3А) по сравнению с разбавленной черепа (рис. 3В) приведены для сравнения результаты ОКТ-изображение с успешным TSCW. Кроме того, корональные поперечного сечения октябряИзображение получается также для содействия в определении срединной линии структуры (рис. 3). Максимальная интенсивность сигнала Рисунок 3 составляет 45 дБ выше уровня шума. Сравнение интенсивности профиля, не разбавленной черепа и черепа показывает, разбавленной большей интенсивности сигнала и глубиной проникновения в модели TSCW (рис. 4).
Рисунок 1. TSCW в мышиной модели. 4 × 4 мм разбавленной черепа окна (обозначены пунктирными в квадрате) создается ~ 1 мм, задних и боковых брегмы за правое полушарие головного мозга с помощью различных стоматологических боров. Право коры (разбавленной до примерно 55 мкм) значительно более прозрачным, чем не разбавленной черепа (левого полушария, 140 мкм) обеспечивает большую глубину проникновения для оптической визуализации с использованием октября β = брегмы, λ = лямбда, SS = sagittАль шва.
Рисунок 2. Октябрь изображений TSCW в естественных условиях. Мышиной модели с разреженных черепа зафиксированы в стереотаксической раме под цель октября изображений в естественных условиях.
Рисунок 3. Октябрь изображений коры головного мозга в естественных условиях. (A) парасагиттальных октября изображение коры при нормальном черепа. (B) парасагиттальных октября изображение коры под разбавленной черепа. (C) корональные октября изображение черепа разбавленной (слева) и нормальные черепа (справа). Структуры мозга визуально более очевидной при TSCW по сравнению с нормальным черепом. Октябрь изображений были получены из тех же мышей в естественных условиях с изображениями размером 50,5 мм × 2 мм с максимальной интенсивностью сигнала на 45 дБ. β = брегмы, CC = мозолистого тела, SS = сагиттального шва, шкалы = 1 мм.
Рисунок 4. Интенсивность профиль сравнение нормальных и разбавленной черепа преп. TSCW позволяет увеличить интенсивность сигнала и глубину проникновения. TSCW достигает изображений глубину около 1 мм с достаточным SNR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Формирование изображений с октября и в разреженных черепа роман нейро-визуализации техника, которая только недавно исследовали 15, 16. В наших экспериментах мы показали возможность SD-OCT изображений через TSCW в мышиной модели в естественных условиях. Из наших результатов, череп сокращается до примерно 55 мкм, а глубина проникновения получается примерно 1 мм с разрешением изображения от 8 до 20 мкм в осевом и поперечном направлении, соответственно. В профилем интенсивности сигнала, OCT изображений через TSCW увеличивает интенсивность сигнала и глубина проникновения по сравнению с нормальным черепом (рис. 4). Для сравнения, двухфотонное изображений с TSCW на черепе толщиной ~ 10-15 мкм может достигать изображений глубине 150-250 мкм ниже поверхности мягкой мозговой оболочки 10, 11, 13 с осевым разрешением ~ 3 мкм 10, а разбавленной череп ~ 20 мкм глубина изображения может доходить до 300-400 мкм в коре головного мозга 12. Overall, оптических изображений с октября окажется перспективным методом визуализации, позволяющая толще TSCW во время прореживания процесса, обеспечивая при этом большую глубину проникновения, чем mutiphoton микроскопии.
Использование разреженных черепа имеет преимущество в оптических изображений, такие как 15 октября, 16 и двухфотонной микроскопии 10-13, поскольку она обеспечивает практически нет нейровоспаления по сравнению с трепанация черепа, если разбавление успешно проведены 11, 12, 15, 16,. Используя трепанация черепа для работы с изображениями, может привести к реактивной микроглии, а также активацию глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) в реактивные астроциты после оскорблений в мозг. Тем не менее, изображение после принятия в разреженных черепа техники показывает неактивные микроглии и слабым иммунным GFAP подразумевая неактивные астроциты 10. При правильном истончение черепа, конкретных структур в кору головного мозга, таких как микроглия морфологии и корковых сосудов, свыделить 11-13. Тем не менее, есть и недостатки использования TSCW для оптического изображения. Если череп не сокращается до требуемой толщины или череп имеет грубую поверхность из-за неправильного истончение глубина проникновения для визуализации может быть ограничена. Еще одним недостатком для бедных глубину изображения могут возникнуть в результате суб-дурального кровоизлияние в связи с колебаниями бурения. Кровотечение под твердой мозговой оболочкой является неизбежным и, следовательно, не может быть использована для визуализации октября. В таких случаях, новая животная модель следует использовать для эксперимента.
Идентификация определенных структур коры использованием октября по TSCW может быть полезно для отслеживания нейродегенеративных заболеваний, а также в изучении изменения в функции мозга. Потока изображений в крови может быть достигнуто за счет доплеровского 17 октября, 18, как количественно мозгового кровотока имеет первостепенное значение в мониторинге метаболические потребности мозга в изучении инсульт, болезнь Альцгеймера 18, или опухоли головного мозга 17. Аксонныйи дегенерации нейронов также видное место в ОКТ-изображений и может принести пользу исследованиям различных заболеваний головного мозга. По изображений сетчатки слоя нервных волокон (RNFL), который содержит ганглиозных клеток аксоны, механизмы нейро-дегенерации, нейро-защиты, и нервно-ремонт могут быть отображены не только в оптическом расстройств, но и неврологических заболеваний, таких как болезнь Паркинсона 19 и несколько 20 склероз, 21, на последнем из которых были детально изучены с помощью измерения макулы 21 и толщиной слоя сетчатки по октябрь методы сегментации 20.
Нейро-визуализации с октября не ограничивается только для визуализации структур и функций мозга. Октябрь может быть полезно при хроническом в естественных изображений 10, 11, а также в стереотаксической процедуры, такие как электрофизиологических исследований и микроинъекции 1, 3, 15-17. В нейрохирургии, октябрь может быть использован как биопсия или направляющих инструмент 2, позволяя хирургам, чтобы просмотретьв реальном времени обратную связь изображения конкретных анатомических особенностей в мозгу 17. При дальнейшем развитии событий, мы считаем, что наша текущая сочетание SD-OCT с TSCW имеет потенциал, чтобы улучшить способность врача к диагностике неврологического дефицита, когда он применяется с другими методами, такие как внутричерепного давления (ВЧД) монитор 22, магнитно-резонансная томография ( МРТ) или компьютерной томографии осевой (CAT) 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Доказательство UC Discovery Концепции грантов и NIH (R00 EB007241). Авторы также хотели бы поблагодарить Жаклин Хаббарду за ее помощь в этом эксперименте.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
- Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
- Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
- Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
- Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G.
- Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
- de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
- de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
- Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
- Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742 (2012).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
- Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
- Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
- Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
- Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
- Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
- Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
- Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
- Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
- Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).
