Summary
Vi presenterar en metod för att skapa en tunnare, skalle kortikal fönster (TSCW) i en musmodell för
Abstract
Optisk koherens tomografi (oktober) är en biomedicinsk bildteknik med hög rumslig-tidsupplösning. Med sin minimalinvasiv metod oktober har använts i stor utsträckning i oftalmologi, dermatologi och gastroenterologi 1-3. Med hjälp av en tunnare, skalle kortikal fönster (TSCW), använder vi spektrala-domän oktober (SD-oktober) modalitet som ett verktyg för bild cortex in vivo. Vanligen har en öppnad-skalle använts för neuro-avbildning, eftersom det ger mer mångsidighet, emellertid, är en metod TSCW mindre invasiv och är ett effektivt medel för långsiktig avbildning i neuropatologiska studier. Här presenterar vi en metod för att skapa en TSCW i en musmodell för in vivo oktober avbildning av hjärnbarken.
Introduction
Sedan introduktionen i början av 1990-talet har oktober använts i stor utsträckning för biologisk avbildning av vävnad struktur och funktion 2. Oktober genererar tvärsnittsdata bilder genom att mäta fördröjningen ekotid av bakåtspritt ljus 4 genom att genomföra låg källa samstämmighet ljus med en fiberoptisk Michelson-interferometer 2,4. SD-oktober, även känd som Fourier-domänen oktober (FD-oktober), introducerades för första gången 1995 5 och erbjuder en överlägsen avbildning modalitet jämfört med traditionell tidsdomän oktober (TD-oktober). I SD-oktober, är hänvisningen armen hålls stilla vilket resulterar i en hög hastighet och extremt hög upplösning förvärv 6-9.
För närvarande har TSCW modeller använts i stor utsträckning för in vivo hjärnröntgen tillämpningar av två-foton mikroskopi i stället för en traditionell kraniotomi. Dessa TSCW har använts samtidigt med en anpassad skalle platta eller ett glas täckglas 10-13 för att ge ytterligare imaging stabilitet. I våra studier har vi observerat att tillbehör som dessa är inte nödvändiga för oktober avbildning när TSCW används. Därför medger avsaknaden av en skalle platta eller glas glider täckning för ett bredare spektrum av avbildande fönsterstorlek som de kan störa den optiska strålen och ändra oktober bilder.
En förtunnade-skalle preparat har visat sig vara fördelaktig i avbildande studier av hjärnan med användning av två-foton-mikroskopi 10-13. I våra experiment använder vi en SD-oktober för att bilden cortex in vivo genom TSCW. Vår egen SD-OKT avbildning installation innehåller ett bredband, låg-samstämmighet ljuskälla bestående av två superluminiscenta dioder (SLD) centrerade vid 1295 nm med en bandbredd av 97 nm resulterar i en axiell och lateral upplösning av 8 pm och 20 pm, respektive 14 . Med vår optisk avbildning enhet föreställer vi oss att avbildning genom TSCW har stor potential i att identifiera och visualisera strukturer och funktioner i Optically tät hjärnvävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kirurgisk beredning
- Honkön CD 1-möss i åldrarna 6-8 veckor användes i våra experiment.
- Söva musen med en intraperitoneal injektion av en ketamin och xylazin kombination (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xylazin). Placera musen på en homeothermic pad att säkerställa optimal kroppstemperatur vid ~ 37 ° C. Kontinuerligt övervaka nivån av anestesi genom att testa djurets reflexer (t.ex. nyper fot med trubbiga pincett) och injicera mer anestesi vid behov.
- Smörj båda ögonen med en konstgjord tår salva. Ta hårstrån i hårbotten med hjälp av en rakkniv och avlägsna rester hår med 70% spritsuddar prep. Applicera ett tunt lager Nair hårborttagning grädde över hårbotten och vänta 2 minuter för den att träda i kraft. Torka försiktigt bort Nair och återstående hår med saltlösning fuktad tops och alkohol kuddar prep. Hårbotten bör nu vara helt hårlösa.
- Desinficera hårbotten med hjälp av en betadin kompress pinne och rengör med 70% etanol prep kuddar.
- Försiktigt svepa djuret i operationsdukar att säkerställa en optimal kroppstemperatur på ~ 37 ° C och montera djuret på en stereotaktisk ram att immobilisera skallen. Knacka lätt på skallen för att säkerställa dess stabilitet. En lista över material som används ges i tabell 1.
2. Förtunnas-skalle Kortikal fönster Förberedelser
- Starta snittet vid mittlinjen punkten mellan ögonen. Fortsätt kaudalt med mittlinjen punkten mellan öronen. Del huden med pincett.
- Leta området som ska gallras under ett dissektionsmikroskop och ta försiktigt bort fascian med pincett. Torka skallen med sterila tops innan du skapar den uttunnade kortikala fönstret. I våra experiment har vi skapat en 4 × 4 mm förtunnad kranial fönster ~ 1 mm bakre och lateral till bregma.
- Börja gallring skallen med en rund hårdmetall borr med borr storlek 0,75 mm i en kirurgisk handborr med ljus svepande rörelse only.. Applicera inte direkt tryck på skallen. Sluta borra var 20-30 sekund för att ta bort ben damm med steril koksaltlösning och kompresser bomull och för att undvika överhettning av skallen. Den saltlösning kommer också stöd i avleda värmen hela skallen.
- När det yttre skiktet av kompakt ben avlägsnas fullständigt i mitten spongiösa benet skiktet bör nu vara synlig. Det kan finnas vissa smärre blödningar som blodkärl är mer uppenbara i porösa benet lagret. Byt till en grön sten bur och fortsätta borra med extra försiktighet som svampiga skikt är känsligare. Den gröna stenen bur kommer att ta bort mindre benmaterial och skapar jämnhet hela kraniala fönstret. Sluta borra då för att ta bort ben damm och att kyla skallen.
- Slutligen, när skallen har blivit öppnare och kärlsystem på hjärnan syns nu, börja polera skallen med en polering bur. Detta kommer att möjliggöra en mer exakt gallring medan utjämning nedåt skallen. Kontrollera tunnhet SKULL genom att försiktigt knacka på den med pincett. Stoppa polering när skallen blir något flexibel.
- Den uttunnade kraniell fönster bör nu vara helt slät och reflekterande och redo för avbildning (figur 1). På grund av karaktären av mycket spridande vävnader i hjärnan, bör skallen förtunnas till minst 55 um för optimal djup inträngning. En lista över material som används ges i tabell 1.
3. Optisk koherens tomografi Imaging
- Efter operation är klar, kontrollera djurets andning och reflexer för att säkerställa rätt nivå av anestesi och administrera ytterligare anestesi vid behov. Ta djur från stereotaktisk ram, hålla djur insvept i operationsdukar och transport djuret till avbildning stationen.
- Innan avbildning kontrollera tecken för reflexer och tillämpa ytterligare artificiell tår om det behövs. Montera djur på den stereotaktisk ram för att säkra skallen.
- Placera djur enligtOktober kamera och placera TSCW enligt den optiska strålen (figur 2). En tvärsnittsvy av skallen och hjärnan kan nu visualiseras (figur 3).
- Datainsamling kan börja så snart område av intresse är beläget. För avbildningsändamål, använder vi galvanometerspegelns speglar för att uppnå en avbildningsanordning fönster med en bredd av 4,0 mm. En avbildning djup av 2 mm erhölls med 6 mW infallande effekt och en brännpunkt 1 mm under tunnas skallen. Varje tvärsnittsarea bestod av 2.048 axiella skanningar med ett förvärv hastighet av 0,14 sek per bild.
- Volymetriska avsökningar av hjärnan kan också erhållas genom att samla en serie 2D tvärsnitt bilder genom användning av två uppsättningar av galvanometern speglar för xy avsökning med den första galvanometerspegeln skannar strålen i den sagittala riktningen och den andra galvanometerspegeln scanning i den koronala riktning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När du skapat ett förtunnat fönster över hjärnbarken kärlsystemet bör nu vara mer visuellt framträdande (figur 1) och kommer att möjliggöra en djupare avbildning djup (upp till 1 mm). Den högra cortex förtunnas till ca 55 | im, jämfört med en vanlig skalle mätt vid 140 nm (fig 1) och ger en större optisk klarhet. Ytterligare gallring till 10-15 um är möjligt 11 men inte nödvändigt eftersom användningen av täckglas och plattor skalle inte genomförs i våra experiment (figur 1 och 2). Denna speciella metod har gett oss möjlighet att identifiera specifika strukturer (hjärnbarken, corpus callosum) i våra oktober tvärsnittsdata bilder (Figur 3). Parasagittal oktober bilder av en vanlig skalle (Figur 3A) kontra ett förtunnad skallen (Figur 3B) visas för att jämföra resultatet av en oktober bild med en lyckad TSCW. Dessutom en koronalt tvärsnitt oktoberbild erhålles även för att underlätta att identifiera mittlinjen strukturer (Figur 3C). Den maximala signalintensiteten för figur 3 är 45 dB över brusgolvet. En intensitet profil jämförelse av en icke-förtunnad skallen och en förtunnad skalle visar en större signalintensitet och djup inträngning i TSCW modell (Figur 4).
Figur 1. TSCW i en musmodell. En 4 x 4 mm förtunnad skallen fönster (betecknas i det streckade rutan) skapas ~ 1 mm posteriort och lateralt i förhållande till bregma över den högra cerebrala hemisfären med användning av olika dentala borr. Den högra cortex (förtunnad till cirka 55 um) är betydligt mer transparent än den icke-förtunnad skallen (vänster kortex, 140 um) ger större djup penetration för optisk avbildning med oktober β = bregma, λ = lambda, SS = sagittal sutur.
Figur 2. Oktober avbildning av TSCW in vivo. En musmodell med förtunnad-skalle är fixerad i en stereotaktisk ram under målet för oktober avbildning in vivo.
Figur 3. Oktober bilder av hjärnbarken in vivo. (A) parasagittal oktober bild av cortex i en normal skalle. (B) parasagittal oktober bild av cortex under en förtunnad skalle. (C) koronal oktober bild av en förtunnad skallen (vänster) och en normal skalle (höger). Strukturerna i hjärnan är mer synliga för blotta ögat under en TSCW jämfört med en vanlig skalle. Oktober bilder från erhölls från samma mus in vivo med avbildning storlek 50,5 × 2 mm med maximal signalstyrka på 45 dB. β = bregma, CC = corpus callosum, SS = sagittalis sutur, skala bar = 1 mm.
Figur 4. Intensitet profil jämförelser av normal och tunnas skalle prep. TSCW tillåter ökad signalintensitet och djup penetration. Den TSCW uppnår en avbildning djup av ca 1 mm med tillräcklig SNR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Avbildning med oktober och en förtunnad-skalle är en ny neuro-bildteknik som bara har nyligen undersökts 15, 16. I våra experiment visade vi genomförbarheten av SD-OKT avbildning genom en TSCW i en musmodell in vivo. Från våra resultat är skallen förtunnas till ca 55 um och inträngningsdjupet erhålls vid approximativt 1 mm med bildupplösning på 8 pm och 20 pm i den axiella och laterala riktningen. I signalintensiteten profilen ökar oktober avbildning genom en TSCW signalintensiteten och djup inträngning i jämförelse med en vanlig skalle (figur 4). Som jämförelse kan två-photon avbildning med TSCW på skalle tjocklek ~ 10-15 um nå avbildning djup 150-250 nm under pial yta 10, 11, 13 med axiell upplösning vid ~ 3 um 10 medan en förtunnad skalle ~ 20 um avbildning djup kan nå upp till 300-400 um i hjärnbarken 12. Overall, optisk avbildning med oktober visar sig vara en lovande avbildning modalitet, vilket möjliggör en tjockare TSCW under gallring processen samtidigt som djupare djup penetration än mutiphoton mikroskopi.
Använda en förtunnad-skalle är fördelaktig i optisk avbildning såsom okt 15, 16 och två-foton-mikroskopi 10-13 eftersom det ger liten eller ingen neuroinflammation jämfört med en kraniotomi om gallring utförs framgångsrikt 11, 12, 15, 16,. Anställa en kraniotomi för avbildning kan resultera i reaktiva mikroglia samt uppreglering av gliafibrillärt surt protein (GFAP) i reaktiva astrocyter efter förolämpningar till hjärnan. Avslöjar emellertid avbildning efter att anta en tunnare, skalle tekniken icke aktiv mikroglia och svag GFAP immunfärgning innebär icke-reaktiva astrocyter 10. Genom korrekt gallring av skallen, specifika strukturer inom hjärnbarken, som mikroglia morfologi och kortikala kärlsystem, cen särskiljas 11-13. Det finns dock nackdelar med att använda en TSCW för optisk avbildning. Om skallen inte förtunnas till rätt tjocklek eller skallen har ojämna ytor på grund av felaktig gallring djupavkänning för avbildning kan vara begränsat. En annan nackdel för dålig avbildning djup kan bero på sub-dural blödning på grund av vibrationer borrning. Blödning under dura är oundviklig och kan därför inte användas för okt avbildning. I fall som dessa, bör en ny djurmodell användas för experimentet.
Identifiera vissa strukturer inom cortex med oktober genom en TSCW kan vara till hjälp för att spåra neurodegenerativa sjukdomar och att studera förändringar i hjärnans funktion. Imaging blodflödet kan uppnås genom Doppler 17 oktober, 18 som kvantifiering cerebralt blodflöde är av största vikt att övervaka metaboliska krav i hjärnan för att studera stroke, Alzheimers sjukdom 18 eller hjärntumörer 17. Axonaloch neuronal degeneration är också framträdande i oktober bilder och kan gynna studier av olika sjukdomar i hjärnan. Genom avbildning näthinnans nerv fiberskiktet (RNFL), som innehåller axoner gangliecell, mekanismer för neuro-degeneration, neuro-skydd, och neuro-reparation kan visualiseras inte bara i optiska störningar utan också i neurologiska sjukdomar som Parkinsons 19 och flera skleros 20, 21, den senare som har undersökts i detalj genom att mäta gula fläcken 21 och retinal tjocklek genom oktober segmentering tekniker 20.
Neuro-avbildning med oktober är inte bara begränsat till avbildning strukturer och funktioner i hjärnan. Oktober kan vara fördelaktigt vid kronisk in vivo imaging 10, 11 liksom i stereotaktiska förfaranden såsom elektrofysiologiska och mikroinjektion studier 1, 3, 15-17. I neurokirurgi kan oktober användas som en biopsi eller styrnings verktyg 2 genom att kirurger för att visafeedback i realtid bilder av specifika anatomiska funktioner i hjärnan 17. Med den fortsatta utvecklingen, tror vi vår nuvarande kombination av SD-oktober med en TSCW har potential att förbättra en kliniker förmåga att diagnos neurologiska bortfall när det tillämpas med andra metoder, såsom en intrakraniellt tryck (ICP) övervaka 22, magnetisk resonanstomografi ( MRT), eller datoriserad axiell tomografi (CAT) 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av UC Discovery Proof of Concept bidrag och av NIH (R00 EB007241). Författarna vill också tacka Jacqueline Hubbard för hennes hjälp i detta experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
- Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
- Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
- Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
- Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G.
- Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
- de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
- de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
- Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
- Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742 (2012).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
- Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
- Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
- Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
- Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
- Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
- Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
- Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
- Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
- Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).
