Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

Resumo

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando o A Bela Adormecida Sistema (SB) para introduzir CD19 específico CAR e propagação seletivo em designer de antígeno CD19 + células artificiais apresentando.

Resumo

A potência das células de grau clínico T pode ser melhorado através da combinação de terapia de genes com a imunoterapia de engendrar um produto biológico, com o potencial de reconhecimento (i) superior de antigénios associados a tumores (TAAs), (ii) após a infusão de persistência, (iii) potencial de migração para o local do tumor, e (iv) a capacidade de reciclar as funções efectoras dentro do microambiente do tumor. A maioria das abordagens para a manipulação genética de células T modificadas para aplicação em seres humanos usaram lentivírus dos retrovírus e para a expressão estável de CAR ^1-3. Esta abordagem, apesar de compatível com Boas Práticas de Fabricação (BPF), pode ser caro, uma vez que conta com a produção e liberação de clínica-grade vírus recombinante a partir de um número limitado de unidades de produção. A transferência de plasmídeos electro-não-virais é uma alternativa atraente para a transdução de ADN uma vez que as espécies podem ser produzidos ao grau clínico em cerca de ^1/10 de o custo de recombinformiga vírus GMP-grade. Para melhorar a eficiência da integração nos adaptamos Bela Adormecida (SB) transposon e transposase para aplicação humana ^4-8. O nosso sistema SB utiliza dois plasmídeos de ADN, que consistem de um transposão que codifica para um gene de interesse (por exemplo, 2 ^ª geração CD19 específico transgene CAR, designado CD19RCD28) e uma transposase (por exemplo, SB11), que insere o transgene no dinucleótido TA repete ^9-11 . Para gerar números suficientes de clinicamente geneticamente modificados células T que usamos K562 células derivadas de antigénios artificiais que apresentam (AAPC) (clone # 4) modificados para expressar um TAA (por exemplo, CD19), assim como as moléculas de co-estimulação de células T CD86, CD137L, uma ligada à membrana versão de interleucina (IL) -15 (péptido fundido a modificação região Fc de IgG4) e CD64 (Fc-receptor γ 1) para o carregamento de anticorpos monoclonais (mAb) ^12. Neste relatório, demonstrar os procedimentos que podem ser realizados em compliance com cGMP para gerar CD19 específico CAR ⁺ células T adequadas para aplicação em seres humanos. Isto foi conseguido através da electro-transferência síncrona de dois plasmídeos de ADN, de um transposão SB (CD19RCD28) e uma transposase SB (SB11) seguido por recuperação de integrantes estáveis ​​pelas adições cada-7-dia (ciclo de estimulação) de γ-irradiado AAPC (clone # 4), na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 ^13. Tipicamente quatro ciclos (28 dias de cultura contínua) são realizadas para gerar números clinicamente atraentes de células T que expressam estavelmente o CAR. Esta metodologia de fabrico de grau clínico de células T específicas para CD19 pode ser aplicada a células T derivadas do sangue periférico (PB) ou sangue de cordão umbilical (UCB). Além disso, esta abordagem pode ser aproveitado para gerar células T para diversos tipos de tumores, emparelhando a especificidade do CAR introduzida com a expressão do TAA, reconhecido pela CAR, na AAPC.

Protocolo

Dia 0 ou Antes

1. Isolamento de células mononucleares (MNC) de PB e UCB

1. Diluir PB com igual volume, e UCB com quatro volumes de PBS-EDTA.
2. Lentamente sangue camada diluída (25 ml) em Ficoll (12 ml) num tubo de centrifugação de 50 ml (s) e centrifugar a 400 xg durante 30 - 40 minutos (sem travagem).
3. Recolher e transferir a fracção de células mononucleares (interface) utilizando uma pipeta de transferência para um novo tubo de centrífuga de 50 ml.
4. Trazer o volume até 50 ml com PBS-EDTA e centrifugar a 450 xg durante 10 min.
5. Aspirar o sobrenadante, gentilmente re-suspender o sedimento de células (s) em 50 ml de meio de cultura completo (CCM) e, centrifugar a 400 xg durante 10 min.
6. Delicadamente ressuspender e piscina as pelotas de células em CCM e realizar uma contagem de células usando Trypan método de exclusão de azul (Cellometer, programa PBMC).
7. EMN pode agora ser utilizado para a electroporação (Nucleofection) ou criopreservados para utilização futura.

título "> 2 Preparação. das Células T para Electroporation no dia 0

1. Se usar MNC criopreservado, rapidamente descongelar células suficientes para uma escala total de electroporação (2 x 10 ⁸ a adição ~ 20% para levar em conta a perda de células durante a centrifugação e 2 horas de incubação) em banho de água a 37 ° C. Se estiver usando o recém isolado MNC avançar para o passo 2.3.
2. Gentilmente re-suspender as células e transferir para um tubo de centrifugação de tamanho adequado (s) pré-aquecida continha completa Fenol livre de cultura meio RPMI (PF-RPMI) e centrifugar a 200 xg durante 10 min (no freio), sobrenadante aspirado.
3. Re-suspender o MNC no PF-RPMI, realizar uma contagem de células (Cellometer) e transferir as células para um recipiente de tamanho adequado das células de cultura (s) a uma concentração de 10 ⁶ células / ml.
4. Incubar em 37 humidificada ° C / 5% CO ₂ incubadora durante 2 horas ± 30 minutos.
5. Transferir o MNC para tubo de centrífuga estéril (s), rotação a 200 xg durante 5 min (sem travões), aspirar o sobrenadante e r suavementee-suspender e combinar o sedimento de células (s) em meio RPMI-PF.
6. Realizar uma contagem de células (Cellometer) e calcular o volume de suspensão de células necessária (2 x 10 ⁸ MNC).
7. Transferir o volume calculado para um tubo de centrifugação estéril de 50 mL e centrifugação a 200 xg durante 10 min (sem travagem).
8. Aspirar o sobrenadante para que nenhuma mídia residuais continua e suavemente volte a suspender tocando lateral do tubo.

3. Eletroporação (Nucleofection) de MNC (Processo de escala completa 10 Usando Cuvetes) no Dia 0

1. Pré-incubar uma placa de 12 poços estéreis com 10 poços, contendo 4 ml de RPMI morno PF-37 em uma humidificado ° C / 5% CO ₂ incubadora.
2. Preparar e pré-aquecer a Lonza Solução Nucleofector kit de células T humanas (reconstituído por instruções do fabricante, www.lonza.com ) a temperatura ambiente em um gabinete de Biossegurança (BSC).
3. Prepare a solução Nucleofector / master mix DNA por adding ul 100 de completada solução Nucleofector, 15 ug de transposão (superenrolado DNA plasmídeo designado como CD19RCD28/pSBSO) e 5 ug de transposase (superenrolado DNA do plasmídeo designado por pCMV-SB11) por reacção / cuvete.
4. Dispersa-se o sedimento de células (do passo 2.8) batendo suavemente na parte lateral do tubo de centrifugação e re-suspensão em solução Nucleofection master mix / DNA (concentração celular final: 2 x 10 ⁷ células/100 uL).
5. Transferir cuidadosamente 100 ul da suspensão de células (do passo 3.4) para cada um de dez (10) cuvettes Nucleofection Lonza, tendo cuidado para evitar bolhas de ar.
6. Toque a cuvete uma vez, e utilizando o programa electroporate U-014 (para as células T não estimuladas).
7. Transferir as cuvetes e a placa de 12 poços (Passo 3.1), para o BSC.
8. Colher as células electroporadas a partir de cada cuvete, usando uma pipeta de transferência Amaxa ponta fina, por adição de ~ 500 uL de meio de cultura pré-aquecido a partir do correspondente poço (placa de 12 poços preparadas em Step 3,1) e voltar a placa a 37 ° C humidificado / 5% de CO ₂ incubadora durante 2 horas ± 30 minutos.
9. Seguindo a incubação de 2 horas da colheita, e transferir as células de todas as cavidades de um tubo de centrífuga estéril.
10. Lave as células por centrifugação a 140 xg durante 8 minutos, a temperatura ambiente, sem travão, aspirar e desprezar o sobrenadante, de modo que nenhum meio residual cobre o pellet celular.
11. Dispersa-se o pellet celular batendo suavemente na parte lateral do tubo da centrífuga e suavemente re-suspender em CCM para obter uma suspensão de célula única.
12. Realizar a contagem de células e ajuste a concentração celular a 10 ⁶ células / ml em CCM.
13. Transferir a suspensão de célula para célula frasco de cultura (s) e colocados no incubador durante a noite.
14. Passos do processo 2,1-3,8 foram repetidas para o controle: EGFP transfectadas células (5 x 10 ⁶ células / cuvete com 5 ug Amaxa controle EGFP plasmídeo super-enrolado, pmaxGFP).

^º dia de 1 de 1 e SubsequenteCiclos de estimulação

4. Análise de Expressão CAR por citometria de fluxo no 1 º dia

1. Colher as células electroporadas e realizar uma contagem de células utilizando Trypan método de exclusão de azul (hemocitômetro).
2. Células de manchas (1-2 x 10 ⁶⁾ com o anticorpo específico para CD3, CD4, CD8, e de IgG humana Fcy (como uma medida da expressão CAR).
3. Adquirir células em FACS Calibur e analisar os dados utilizando software FCS Express para calcular a expressão do CAR.
   1. Calcule células ⁺ carro na cultura pela fórmula:
      (N º de Total de células viáveis) x (CAR% ⁺ células) = Número de carro ⁺ células

5. Preparação de AAPC (clone # 4) no Dia 1. AAPC (clone # 4) foram derivadas de células K562 (linha parental Obtido a partir de American Type Culture Collection) com Co-express T Molecule célula desejada Co-estimulação

1. Descongelar uma alíquota congelada de AAPC 100 Gy irradiada em um 37 °; C banho de água.
2. As células são lavadas duas vezes por centrifugação a 400 xg, 10 min em CCM e contados utilizando Cellometer (exclusão Trypan azul).
3. Calcular o número de AAPC viável necessário para a estimulação:
   (Número de carro ⁺ células) x 2 = N º de AAPC irradiado exigido

6. AAPC mediada por estimulação do CAR ⁺ Células T no dia 1 Início do 1 ^º e ciclos de estimulação subseqüentes

1. Misturar as células electroporadas (expressando CAR) e γ-irradiado AAPC (clone # 4) em um recipiente estéril numa proporção de 1:2 (células CAR ^+: AAPC viável) em CCM.
   1. Note-se a relação de AAPC é ajustado para a expressão de CAR baseado em citometria de fluxo no dia após a electroporação.
2. Adicionar IL-21 (30 ng / ml) à suspensão de células.
3. Alíquota em T-75 cm ² frasco (s) e / ou bolsas de Vida Vue cultura a uma concentração de 10 ⁶ células / ml, e retornar para o incubatou.

Dias 3, 5

7. Continuação de Cultura CAR ⁺ Células T

1. Realizar uma mudança de meio media, reabastecer IL-21, e manter as células T a uma concentração de 10 ⁶ células / ml.

Dia 7

8. Fim do ciclo de estimulação Primeiro AAPC mediada

1. Células colheita, contar e mancha para CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e vá para a etapa 10.1.

9. Depleção de células CD56 ⁺ (geralmente entre 7 e 14 dias após a electroporação)

1. Executar uma depleção de CD56 usando esferas paramagnéticas se CD56 + CD3 linfócitos ^neg ≥ 10%.

Ciclos de estimulação # 2, # 3, # 4 e correspondente aos dias 8 → 14, Dias 15 → 21, e dias 22 → 28

10. Adição recursiva da AAPC para propagar as células T a números Clinicamente-suficientes

1. Repita o stimulation processo (4 vezes), tal como descrito nos passos 4,3-8,1.
2. Adicionar IL-2 (50U/ml) para as culturas que começam nos dias 7, 14 e 21, e em seguida, em cada mudança de mídia (três vezes por semana, em um horário de segunda a quarta-feira e sexta-feira).
3. Criopreservar (arquivo) excesso de células T, conforme necessário.
   1. As células T congeladas usando congelador taxa controlada.

Dia 28

11. Fim do ciclo de estimulação Última AAPC mediada: Células T Colheita

1. Criopreservar células T para testes de libertação e de infusão.

Resultados

Relatamos que a transferência de electro-de cosmídeos e propagação de células T em γ-irradiado AAPC pode ser usado para gerar números clinicamente atraentes de células T derivadas de PB e UCB para aplicações em seres humanos. Estas células T geneticamente modificadas de expressar uma CAR introduzida que reconhece o CD19 TAA, independente do complexo de histocompatibilidade principal. Os plasmídeos derivados de SB DNA para expressar o transposão (i), uma 2 ^ª geração CAR (CD19RCD28) que os sinais por meio de CD28 e CD3 ^ε-14, e (ii) transposase, SB11 ^15, foram descritos anteriormente ^{13, 16,17} . Os plasmídeos utilizados no presente estudo foram produzidas comercialmente por Waisman unidade de biomanufatura clínica (Madison, WI). A AAPC (clone # 4), derivada de células K562 (linha parental obtida American Type Culture Collection), co-express de células T desejados moléculas co-estimuladoras (cada molécula introduzida em ³ a 90% na superfície das células de AAPC),como previamente descrito ^12. Aqui, mostramos que as células T específicas para CD19 podem ser gerados a partir de células mononucleares (MNC) a partir de derivados PB ou SB UCB utilizando transposição para introduzir o CAR, seguido pela adição de AAPC para numericamente expandir as células T de uma forma dependente do CAR (Figuras 1 , 4) ^13,18. Dez cuvetes (2x10 ⁷ MNC / cuvete) são electroporados para cada destinatário, utilizando 15 ug de ADN do plasmídeo (CD19RCD28/pSBSO) que codifica para a transposão (CAR) e 5 ug de ADN do plasmídeo (pCMV-SB11) que codifica para a transposase (SB11). O número de cubetas pode ser reduzido se MNC estão limitando ou reduzidas para o trabalho de laboratório. O dia da electroporação é definido como "0 Dia" ciclo de estimulação # 1. Como controles para a citometria de fluxo e as condições de cultura, as células T autólogas são electroporated simulado (sem ADN de plasmídeo) e numericamente expandido em γ-irradiado AAPC (clone # 4) que tinha sido pré-carregada com OKT3 para atravessar link-CD3 das células T para sustentar proliferação. Nós routinely avaliar a eficiência de electrotransferência e viabilidade das células T no dia após a electroporação (Figura 2B). A expressão de GFP de controlo de ADN de plasmídeo (designado pmaxGFP) e CAR, neste ponto de tempo inicial reflicta a expressão da proteína a partir do plasmídeo integrado e epissomal. Normalmente, o dia após a eletroporação medimos expressão EGFP em ~ expressão 60% e CARRO em ~ 40% (Figura 2) com T viabilidade celular entre 40-50%. Adições recursivas de γ-irradiado AAPC, na presença de IL-2 recombinante humano solúvel e IL-21 recuperar as células T que expressam estavelmente CARRO (CD19RCD28). CD3 ^neg células CD56 ⁺ NK estão esgotados a partir da cultura usando esferas paramagnéticas CD56-específicos, se a percentagem das células NK é ≥ 10% e, especialmente, se a percentagem de CAR expressado nas células T é baixa. Isto impede que o esgotamento rápido crescimento excessivo das células NK, que interfere com a capacidade de sustentar a AAPC proliferation da CAR ⁺ células T. Em certas ocasiões, a depleção de células NK de CAR ⁺ células T é realizada durante os últimos dois ciclos de estimulação, mas introduz-se uma perda de células desejadas devido a co-expressão de CD56 em alguns CAR ⁺ células T. As células T foram cultivadas em um sistema funcionalmente fechado usando sacos de cultura Vue Vida passado dia 14. Um subconjunto de células geneticamente modificadas e propagadas T são tipicamente criopreservadas no Dia 14 ou Dia 21 (fim dos ciclos de estimulação # 2 ou # 3) de co-cultura em AAPC para servir como uma fonte de material de arquivo para análises futuras e ser descongelado, se problemas imprevistos posteriormente ocorrer durante o processo de fabricação. As células T são tipicamente colhidas em ou cerca do dia 28 de cultura (Figura 3) que expressam rotineiramente> CAR de 90% e são> 80% de viabilidade (Figura 2C e D). Nós já haviam demonstrado que, após quatro semanas de co-cultura sobre AAPC a média de expansão vezes maior de células T CD3 + é 19.800 ± 11.313 com CA R expressão ⁺ sendo 90% ± 7,5 ^13. Estas células T são criopreservadas e sofrer em processo e testes de liberação que informa sobre a segurança e potencial terapêutico do produto fabricado. Testes de liberação é realizada em conformidade com as alterações laboratoriais clínicos de melhora (CLIA) para gerar um certificado de análise antes da infusão para destinatários em ensaios clínicos.

Figura 1. Passos delineando o processo de electroporate e propagar CAR + células T de PB e UCB. Clique aqui para ver maior figura .

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Figura 2. Caracterização das células T geneticamente modificadas de PB. (A) A expressão de GFP no Dia 0 do ciclo de estimulação primeiro a avaliar a eficiência da transferência de genes. A expressão de CD19-specific CARRO (CD19RCD28), tal como avaliado por citometria de fluxo em células CD3 ^+, CD8 ⁺ e células T CD4 ⁺ em (B), aproximadamente, 24 horas após a electroporação e (C) 28 dias após a co-cultura em AAPC. Expressão semelhante da CAR foi observado com as células T derivadas de SCU. (D) Cinética de expressão CAR. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Propagação da PB-derived CAR+ T células Rate. De expansão numérica de células CD3 ⁺ e ⁺ CAR células T derivadas de PB repetido por co-cultura em γ-irradiada na presença de AAPC solúvel recombinante humano IL-2 e IL-21. Setas ascendentes indicam as adições de γ-irradiado AAPC que marcam o início de cada ciclo de estimulação. Células UCB derivado carro ⁺ T apresentam taxas semelhantes de expansão numérica.

Figura 4. Esquemática do processo de fabricação usando SB e sistemas AAPC modificar geneticamente e propagar CAR ⁺ células T derivadas de PB e UCB. CD19 específico CAR ⁺ células T foram geradas pela transferência de electro-SB-derivados plasmídeos de ADN super-enrolado e subsequente co-cultura em K562-derived AAPC (clone # 4), na presença of IL-2 humana recombinante solúvel e IL-21. Clique aqui para ver maior figura .

A origem das células T	Transposon *	Transposase	Infusão de células T	IRB #	NIH-OBA #	# IND
Autólogo (paciente derivado) **	CD19RCD28	SB11	Depois de transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas	2007-0635	0804-922	14193
Alogênico (doador-derivada)	CD19RCD28	SB11	Após o transplante alogênico de células-tronco hematopoéticas	2009-0525	0910-1003	14577
Alogênico (doador-derivada)	CD19RCD28	SB11	Após o transplante alogênico de sangue de cordão umbilical	2010-0835	1001-1022	14739

* Tabela 1. Os ensaios clínicos, sob os auspícios da FDA em MDACC para infundir CD19 específico CAR células T ⁺ propagado em AAPC. As células T são prestados específico para CD19 através da expressão forçada de SB transposon codifica para uma CAR 2 ^ª geração, CD19RCD28 designado, que os sinais através de CD28 e CD3-ε. ** Teste descrito na referência ^5.

Discussão

Transposon e sistemas de transposase, tais como a partir de ^12,19 piggyBac e SB ^18,20-22, são não-virais abordagens para a terapia genética, que são uma alternativa aos viral mediada por transdução do CAR grau clínico ⁺ células T. O SB foi escolhido como o sistema de transferência de genes com base no seu potencial para a terapia de gene humano ^1,6,23. Nós desenvolvemos as tecnologias duais de SB transposição (para introduzir um CAR) e adição de γ recursiva irradiado AAPC (para recuperar as células T geneticamente modificadas que expressam estavelmente um CAR) para servir como plataforma de tecnologias para o fabrico de células T específicas para TAA em conformidade com cGMP para a Fase I / II de ensaios (Figura 4). Após 28 dias (quatro ciclos de 7 dias de estimulação) de co-cultura sobre γ-irradiado AAPC, que são tipicamente capazes de produzir, pelo menos, ~ ¹⁰ 10 geneticamente modificados células T adequado para aplicações em seres humanos. Conforme necessário, ciclos de estimulação adicional pode ser realizada to gerar grandes números de células T geneticamente modificadas. Além disso, se as células menos CAR ⁺ T são necessários, a aproximação a electroporação e propagação pode ser reduzida para menos empregando cuvetes e levar adiante, apenas um conjunto de sub-das células T expandidas numericamente para ciclos subsequentes de proliferação de AAPC, no início de cada ciclo de estimulação. A maioria da electroporação e propagadas as células T colhidas para perfusão estavelmente expressam o CAR. A conseqüência de células CD4 ⁺ e CD8 ⁺ T que expressam nossa CAR 2 ^ª geração incluem as células com um fenótipo de memória / ingênuo e apresentam três características de re-direcionado especificidade. Em primeiro lugar, as células geneticamente modificadas especificamente T lisam alvos CD19 ^+, por outro lado, produzem IFN-γ em resposta a células CD19 ⁺ do estimulador e, em terceiro lugar, se proliferam em resposta a CD19 ⁺ células alimentadoras, todos de uma maneira dependente da CAR ^13,18. Nossa abordagem para integrcomeu um transgene CAR por eletro-transferência de plasmídeos não-virais de DNA a partir do sistema SB pode ser realizado em repouso células T primárias derivadas de PB e UCB. Nós e outros autores geneticamente modificado células K562 para servir como AAPC para propagar eficientemente números clinicamente suficiente de células T para infusão de ^24,25. A AAPC e ambiente de cultura de tecidos (por exemplo, a adição de IL-21) foram foram modificadas para gerar paciente e doador-derivado de células CD19-T específicas para a infusão após o transplante de células-tronco hematopoiéticas (Tabela 1) ^13,18. Nós podemos produzir CAR + células T de PB simplesmente obtidas por punção venosa que evita o custo, desconforto e inconveniência de se obter a partir de PB MNC por aférese. A capacidade de derivar um grande número de células T ⁺ CAR de pequenos números de MNC é particularmente atraente para a infusão de células T após transplante alogénico da UCB. O pequeno tamanho e anonimato do doador neonatal impede re-Aceder a este indivíduo em um ponto de tempo mais tarde, e apenas um número limitado de colheita MNC estão disponíveis como material de partida para a fabricação de células T para evitar interferir com a hematopoiese. Outros avanços para o processo de fabricação estão em andamento para incluir um dispositivo de electroporação elevado rendimento acoplado com um biorreactor WAVE totalmente fechada para minimizar a manipulação. No agregado, o SB e AAPC plataformas são atraentes para gerar CD19 específico CAR ⁺ células T que podem ser adaptados para gerar grandes números de células T geneticamente modificadas que podem reconhecer alternativas da superfície celular TAAs em conformidade com cGMP.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes	Vendedor	Número de catálogo
			Reagentes
DNA expressando GFP plasmídeo (pmaxGFP)	Lonza	APV-1002 (kit)
PBS	Sigma	D8537
CliniMACS PBS-EDTA	Miltenyi Biotec	70026
HyQ RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30096.01
Fenol livre de RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30605.01
De soro fetal bovino Hyclone	Thermo Scientific	SH3007003HI
GlutaMAX(100x)	Gibco	3505-061
Ficoll-Paque	GE Healthcare Biosciences	17-1440-02
IL-21 humana recombinante	PeproTech	AF-200-21
IL-2 recombinante humano (Proleukin)	Novartis	NDC 65483-116-07
Kit de células T humanas (Solução Nucleofector)	Lonza	VPA-1002
CliniMACS Reagente CD56	Miltenyi	70206
Conjugado com FITC para rato mAb específico para CD3 humano	BD Biosciences	349201
APC-conjugado com o mAb de rato específico para CD4 humano	BD Biosciences	340443
PerCPCy5.5 conjugadopara rato mAb específico para CD8 humano	BD Biosciences	341051
PE-conjugados com F (ab ') 2 de fragmento de anticorpo de cabra específico para o humano Fcy	Invitrogen	H10104
Azida de sódio	Sigma	S2002
			Descartáveis
Placa de 12 poços	Corning	3513
T-75 cm 2 balão	Corning	430641
Sacos de Cultura	Vue Vida	290C; 750C
50 tubo de centrífuga ml	BD Biosciences	352098
			Equipamentos
Amaxa Nuceleofector II	Lonza	AAB-1001
Cellometer	Nexcelom Bioscience	Visão Cellometer
Sorvall Legend Centrífuga RT	Sorvall	75004377
BD FACS Calibur	BD Biosciences	342975
Congelador taxa controlada	Cunha	Kryo 750
Irradiador	CIS bio Internacional	IBL-437 C # 09433
			Nome>comum Expressão de moléculas (endógena e Introduzido) Linha Celular Tipo de célula Moléculas expressas CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clone 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-expresso com a membrana ligada a IL-15 < td Meios de cultura completos (CCM) (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 FBS a 10% 1% GlutaMAX Tampão de Citometria de Fluxo (armazenada a 4 ° C durante até 30 dias) PBS FBS 2% 0,1% Azida de sódio