Artigo de método

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

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DOI:

10.3791/50088

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24 de março de 2013

 ,  , 
1Watson School of Biological Sciences, 2Cold Spring Harbor Laboratory, 3Departments of Medical Genetics, University of Oslo and Oslo University Hospital

Neste artigo

Resumo

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento anti-cancro In vivo E a resolução de células simples.

Resumo

O microambiente do tumor desempenham um papel crucial na iniciação do tumor, progressão, metástase, e a resposta a terapias anti-cancro. Tridimensionais co-cultura de sistemas são frequentemente usados ​​para explicar a tumores do estroma interacções, incluindo o seu papel na resposta de drogas. No entanto, muitas das interacções que ocorrem in vivo no microambiente intacta não pode ser completamente reproduzido nestas configurações em in vitro. Assim, a visualização direta destes processos em tempo real tornou-se uma ferramenta importante na compreensão das respostas tumorais às terapias e identificar as interações entre as células cancerosas e do estroma que pode influenciar essas respostas. Aqui nós fornecemos um método para a utilização de microscopia confocal de disco giratório ao vivo, ratos anestesiados para observar directamente de distribuição de medicamentos, as respostas celulares de cancro e alterações no tumor do estroma interacções após a administração de terapêutica sistémica em modelos de cancro da mama. Descrevemos os procedimentos para labeling diferentes componentes do tumor, tratamento de animais para a observação de respostas terapêuticas, bem como o procedimento cirúrgico para expor tecidos tumorais para imagiologia de até 40 horas. Os resultados obtidos com este protocolo são lapso de tempo em que os filmes, os processos tais como a infiltração de drogas, a morte de células cancerosas e a migração das células do estroma pode ser avaliada utilizando o software de análise de imagem.

Introdução

Os tumores sólidos são constituídos por dois compartimentos principais: células de cancro e os componentes do estroma (tanto celulares e não celulares) que ajudam na manutenção de um ambiente adequado para o crescimento do tumor 1. Estes componentes do estroma desempenham papéis críticos no desenvolvimento, progressão e metástase de vários tipos de cancros, incluindo os da mama 2-5. O ambiente também influencia estromal respostas terapêuticas 2,4,5. Assim, determinar como as células cancerosas responder às terapias convencionais e novel dentro do contexto do microambiente intacto é importante para favorecer a nossa compreensão da biologia do cancro e na melhoria actuais estratégias terapêuticas. Além disso, a definição de como cancro das células do estroma interacções mudar após a administração da terapia é crítica para a compreensão da biologia de recidiva tumoral.

Organotípicas co-cultura de sistemas têm sido úteis para o estudo de tumores do estroma interacções 6, mas é evidente que os métodos actualmente disponíveis não podem com sucesso recapitular o microambiente do tumor intacto in vitro, em particular no que diz respeito à função vascular e recrutamento de células imunitárias. Com efeito, as respostas celulares de cancro para terapias que são observadas in vitro muitas vezes são significativamente diferentes dos observados in vivo, onde o microambiente está intacta 5. Assim, em modelos in vivo para o estudo de tumores do estroma interações e seu impacto sobre a resposta terapêutica pode refletir melhor os mecanismos clinicamente relevantes 7.

O principal meio de estudar as respostas para a terapia anti-cancro in vivo tem sido através de medições do tamanho do tumor e exame histológico de tecidos derivados de animais ou de pacientes tratados. No entanto, os avanços na microscopia e repórteres fluorescentes mais nas últimas duas décadas permitiram a visualização dos processos inter e intracelularem alta resolução em animal vivo, anestesiados (intravital imagem) 8. Estas tecnologias de microscopia intravital provaram ser especialmente valioso para espacialmente e temporalmente dissecando a dinâmica de tumor in vivo de interacções a-estroma resolução celular e subcelular 8,9.

Os processos que foram desvendados por imagiologia intravital incluem anti-tumor a citotoxicidade das células T 10,11, as interacções entre as células T e as células mielóides 12, a dinâmica das modificações na composição de colagénio e organização após o tratamento terapêutico 13, macrófagos dependente intravasation célula cancerosa e metástase 14, e permeabilidade vascular 15.

Existem três principais requisitos para imagiologia intravital. Estes incluem a preparação adequada exposição dos tecidos e para geração de imagens, marcação fluorescente dos componentes do tecido de interesse, e um par de microscopia câmara-sistema capaz de adquirir imagens de 16. As estratégias mais comuns utilizadas para atender a esses requisitos incluem: 1) os preparativos heterotópicos (por exemplo, a inoculação do orbital orelha ou olho), permanente Windows Imaging, ou preparações exteriorizado (por exemplo, retalho de pele dorsal), 2) transgênicos fluorescentes e repórteres.. injetáveis ​​fluorescentes para identificar os componentes do tecido, e 3) sistemas de microscopia confocal multifotônica ou emparelhado com tubos fotomultiplicadores ou charge-coupled device (CCD) câmeras, respectivamente 9. Usamos um modelo de retalho cirurgicamente preparado pele para expor a glândula mamaria inguinal para imagens em animais anestesiados que expressam transgenes que codificam os repórteres fluorescentes. As imagens são obtidas ao longo de um período de 12 a 40 horas utilizando um CCD intensificada (ICCD) câmara emparelhado com um sistema de fiação de disco de quatro a laser microscópio confocal 17. Imagiologia desta forma, permitiu-nos estudar os processos, tais como in vivo de distribuição de droga, dependente da fase chrespostas emotherapeutic, tipo de quimioterapia induzida morte celular, e o comportamento de células mielóides 5.

Nós fornecemos um protocolo para a criação de imagens intravital de respostas de células cancerosas para anti-câncer de terapia e de tumor do estroma interações em modelos do rato do câncer de mama. Este protocolo pode ser usado para controlar os comportamentos e morte de tanto as células cancerosas e componentes do estroma com uma grande variedade de transgênicos e injetáveis ​​etiquetas fluorescentes em ambos os modelos transgênicos e transplante por períodos de até 40 horas em uma sessão de imagem única.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com diretrizes e normas para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia por parte da Animal Care Institucional e Comitê local de uso.

1. Geração de Tumores mamários rato para Imaging (transgênica ou ortotópico)

  1. Gerar tumores mamários para imagens utilizando modelos de ratos geneticamente modificados (por exemplo, rato vírus do tumor mamário repetição terminal longa [MMTV]-polioma meio T antígeno [PyMT] ou o rato C3 (1) promotor antígeno T impulsionado grande (Tag) de SV40 [C3 ( 1)-Tag] modelos) ou modelos de transplante ortotópico (singênico, alogênico, ou xenogénica).
  2. Etiqueta de células cancerosas através do cruzamento modelos geneticamente modificadas com linhas transgénicas repórter (por exemplo, ACTB-ECFP) ou utilizar a manipulação ex vivo de células de cancro ou linhas celulares primárias (por exemplo, transdução) seguido por transplante. Para um exemplo de protocolo para transplante ortotópico, see 18.

2. Componentes visualização do microambiente do tumor ou subcelulares Components

  1. Visualizar os componentes do tumor usando rótulos transgénicas. Crossbreed geneticamente modificados modelos de tumores em camundongos transgênicos repórter (por exemplo, c-fms-EGFP para as células mielóides ou ACTB-H2B-EGFP para núcleos) ou usar ratos como receptores de transplante, tecidos rotulados. Isto permite a visualização das interacções célula-cancerosas de células do estroma em resposta ao tratamento ou alterações nucleares associados com a morte celular, respectivamente.
  2. Visualizando o microambiente de usar os injetáveis. Uma grande variedade de agentes (por exemplo, anticorpos marcados com fluorescência ou corantes químicos) podem ser usados ​​para marcar vários componentes do tumor. Dependendo da semi-vida do que o corante e a resposta de um está interessado em rastreamento, o injectável pode ser administrado antes do início da imagiologia ou durante a sessão de imagiologia por via intravenosa (iv). Ou intraperitoneally (ip., Figura 1).

3. Microscópios e software de imagem

  1. Microscópio. Uma variedade de sistemas de microscópio e software pode ser utilizado para a imagiologia de ratos vivos. Os sistemas mais utilizados são microscópios confocal ou multifotônica. Usamos um micro-lensed microscópio confocal de disco giratório (Solamere Technologies, Salt Lake City, UT) com uma câmara de ICCD (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
  2. Software de imagem. Nós usamos o μManager software de código aberto (Vale Lab, da Universidade da Califórnia, San Francisco [UCSF]).
  3. Análise de imagem. Usamos Imaris (bitplane), Volocity (PerkinElmer), e ImageJ (Instituto Nacional de Saúde [NIH]) para análise de imagem.

4. (Pré)-tratamento dos Animais de imagem

  1. Inguinais tumores mamários são ideais para imagiologia, usando o nosso protocolo quando o maior diâmetro mede aproximadamente 8 mm ou menos por pinça mensurávelement.
  2. Para os animais tratados com a imagem de um inibidor de molécula pequena, anticorpo terapêutico ou droga quimioterapêutica, iniciar o tratamento antes ou durante a imagiologia, como requerido para a experiência. Por exemplo, a imagem latente de extravasamento de drogas e de distribuição requer administração depois de imagem tiver sido iniciado (Filmes 1 e 2), enquanto a imagem latente da morte celular induzida pela doxorubicina quimioterápico é bem capturado pela imagiologia de partida 24 horas ou mais, após tratamento com medicamentos (3 Filmes e 4).

5. Preparação de solução salina para manter a hidratação e Sangue osmolaridade do animal durante o exame

  1. Desenhar a cerca de 1 ml de PBS 1x para uma seringa de 1 ml. Iodeto de propídio (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, diluído 1:15) pode ser adicionado a esta solução que será administrada periodicamente (ip.) Durante a sessão de criação de imagens. Isto irá permitir a formação de imagens do núcleo de células mortas ou a morrer que têm as membranas celulares permeáveis. PI tem um hal muito curtof-vida na vasculatura e deve, portanto, ser re-administrado ao longo da sessão de imagem.
  2. Anexar um conjunto de infusão alada (calibre 23, agulha ¾ polegada, 12 tubos de polegada) e esta seringa e empurre a solução através do tubo até que uma gota de solução salina sai da ponta da agulha na extremidade do tubo.
  3. Remover a seringa do conjunto de infusão, e enchê-lo com a solução salina apropriada.
  4. Volte a colocar a seringa ao conjunto de infusão, tomando cuidado para não introduzir bolhas na linha.

6. Preparação do Sistema de anestesia com isoflurano

  1. Adicione água para o nebulizador e aperte-o no lugar. Isto irá humidificar os gases fornecidos ao animal, evitando a irritação dos pulmões e prolongar a sobrevivência dos animais sob anestesia de longa duração.
  2. Encha o tanque de isoflurano para a linha superior. ATENÇÃO: O isoflurano é um anestésico potente que pode também afetar o pesquisador. Sistemas de vácuo apropriadas deve be para assegurar que os gases em excesso são removidos da área.
  3. Ligar tanto o tanque de oxigénio e de azoto e os tanques de ajuste do fluxo. A corrente de azoto deve ser de cerca de 1,0 L / min, enquanto que o oxigénio deve ser de cerca de 0,2 L / min (~ 21%).
  4. Ligue o vácuo (em casa). O vácuo deve ser de cerca de 1,2 l / min.
  5. Confirmar que a linha de anestesia para a câmara de indução é aberto, e as linhas para a área da cirurgia e do microscópio são fechadas.
  6. Confirmar que o saco de respiração látex ligado ao sistema de anestesia é insuflado. Se a bolsa não inflar, substituí-lo.
  7. Verifique o diafragma de borracha em cada um dos cones de ogiva entrega de anestesia com a platina do microscópio e a plataforma cirúrgica. Se a borracha está começando a fina, substituí-lo.

7. Preparação de instrumentos cirúrgicos e plataforma cirúrgica

  1. Ligue um esterilizador quente talão e deixá-la atingir> 200 ° C.
  2. Lave os instrumentos cirúrgicos com água e sabão(Um par de fórceps [de preferência, com os dentes] e uma tesoura para cortar através da pele do animal, um par de fórceps [de preferência serrilhada] e as tesouras de exposição adicional do tumor).
  3. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos para pelo menos 30 segundos usando o talão quente esterilizador (alternativamente, os instrumentos cirúrgicos podem ser esterilizados com antecedência).
  4. Deixe os instrumentos cirúrgicos refrescar enquanto certificando-se de evitar a contaminação dos instrumentos esterilizados.
  5. Colete a tampa para um refrigerador de transporte de isopor. Esta será a sua plataforma cirúrgica.
  6. Coloque um pedaço de uma imersão de laboratório em cima da tampa de isopor (suficiente para cobri-lo).
  7. Apor um cone de nariz com uma linha com o sistema de anestesia com a imersão de laboratório com a fita de laboratório (1 "fita funciona melhor aqui). Insira uma 18 G x1 ½" agulha através da fita na tampa de isopor em ambos os lados do cone de nariz para manter o cone do nariz no lugar.
  8. Separe betadine, gaze esterilizada, dois toalhetes isopropanol a 70%, de um microscópioslides, Krazy Glue, e quatro pedaços de fita laboratório (½ "de largura).

8. Preparação do Microscópio

  1. Ligue o microscópio, a câmera eo computador com o microscópio.
  2. Ligue a manta de aquecimento.
  3. Se um microscópio invertido é para ser usado, uma inserção de fase sob medida deve ser desenhado com portas de imagens correspondentes à localização das mamas inguinais. Limpar o palco inserir bem com água e sabão e secos. Use fita laboratório (½ "funciona melhor) para fixar tampa de vidro (# 1.5 espessura) sobre as portas de imagens e limpar toda a superfície com 70% de isopropanol. Cubra o palco com gaze estéril para proteger contra a contaminação. Coloque a inserção fase do estágio e permitir que o ar seco.
  4. Rasgar 4-6 pedaços de fita adesiva de laboratório (1 "de largura), de cerca de 6 centímetros de comprimento e ligá-las para o lado do microscópio. Estes pedaços de fita vai ser usada para posicionar a anestesia cone de nariz entregar ao animal de umad fixá-la no lugar.
  5. Rasgue mais duas peças de fita (½ polegada de largura), que são cerca de um centímetro de comprimento. Estas serão usadas para manter a agulha de borboleta entregar PBS para o rato e a lâmina de microscópio utilizado para expor o tumor no local.

9. Expor a glândula mamária inguinal for Imaging

  1. Anestesiar os animais numa câmara de indução, utilizando 4% de isoflurano com 21% de oxigénio e nitrogénio equilíbrio (taxa de fluxo de cerca de 1,0 L / min) como gás de transporte. Isso deve levar 2-4 min.
  2. Transferir o mouse para a plataforma cirúrgica, uma vez que está a respirar profunda e lentamente, com a superfície ventral voltada para cima. Abrir o tubo de anestesia cirúrgica para a plataforma e, em seguida, fechar a linha de anestesia para a câmara de indução, por esta ordem para evitar a pressão muito elevada no sistema de anestesia. Reduzir a concentração de isoflurano, de 4% a 2,5% no momento.
  3. Verifique o reflexo interdigital para confirmar que o animal é suficientemente anesthetized para o procedimento cirúrgico através da realização de uma pitada pata. O animal é anestesiado adequadamente se não reagir (por exemplo, espasmo ou enrolar a cauda), para o aperto da almofada da pata. Se o animal não reagir ao aperto da pata, o aumento da concentração de isoflurano.
  4. Fixe os membros do mouse para a plataforma cirúrgica com fita laboratório (½ fita "funciona melhor para isso).
  5. (Opcional) Uma vez que o animal é preso à plataforma cirúrgica, o cabelo pode ser removido a partir da superfície ventral utilizando uma máquina de barbear electrónico. Se depilação química é a preferida, esta deve ser realizada 24-48 h antes da cirurgia. Remover o cabelo antes da cirurgia ajuda a evitar a contaminação do local de imagem, tal como os cabelos dispersos podem induzir fortes respostas imunes e aguda.
  6. Desinfectar a superfície ventral do animal com 70% de isopropanol e toalhetes Betadine.
  7. Usando o primeiro par de tesouras e pinças esterilizadas (com dentes), fazer uma incisão na linha ventral subcutâneaque vai de ~ 3 mm acima da uretra até o apêndice xifóide. Tome cuidado para evitar a perfuração ou corte através do peritônio.
  8. Usando o segundo par de tesouras e pinças esterilizadas (serrilhada), solte da pele, com a glândula mamaria inguinal em anexo, a partir da cavidade peritoneal.
  9. Tomar uma lâmina de microscópio de vidro e posicioná-lo contra a aba de pele gerado na etapa anterior. Posicionar a lâmina de tal modo que o volume do tumor vai ficar plana uma vez que o rato é colocado sobre o palco e que não interfira com a mobilidade dos membros posteriores.
  10. Uma vez que a lâmina de microscópio foi devidamente posicionada, coloque a corrediça para a superfície externa da pele usando supercola (por exemplo., Krazy Glue).

10. Posicionando o mouse no Palco

  1. Remover a fita de fixação laboratório dos membros do animal, para a plataforma cirúrgica.
  2. Abra a linha de anestesia para o estágio do microscópio e fechar a anestesiasia de linha para a plataforma cirúrgica, por esta ordem.
  3. Transferir rapidamente o animal para a platina do microscópio.
  4. Uma vez que o animal tenha sido transferido, a posição e fixar a linha de anestesia e cone de nariz adequada (por exemplo, usando uma fita de laboratório) para garantir que o rato continua a ser anestesiado e está numa posição confortável.
  5. Expor o tumor de modo que fique posicionado na parte superior e no centro de uma das cobertura de vidro cobertas de portas de imagens na platina do microscópio.
  6. Usando as oculares, verificar se o tumor está posicionada corretamente, e gentilmente fita para baixo a lâmina de microscópio. A corrediça deve ser assegurada de modo solto o fluxo sanguíneo para o tecido não está obstruída. Gravando-se a lâmina do microscópio ajuda a minimizar artefatos de imagem introduzidos pela respiração do animal.
  7. Inserir a linha indwelling intraperitoneal com infusão alado conjunto ligado a uma seringa de 1 ml contendo 1x PBS estéril ou solução salina (contendo, opcionalmente, um corante tal como PI) preparado sob o n º 5. Inject o animal com 100 ul quando o ip. linha é inserida. A partir deste ponto de tempo até ao fim da sessão de imagiologia, injectar o animal com 50 ul de solução salina com intervalos de 1 hora (ou 25 ul de solução salina com PI a cada 30 minutos).
  8. Para monitorar os sinais vitais do animal, coloque uma sonda oxímetro (por exemplo, sistema MouseOx por Starr Life Sciences, Inc.) 19.
  9. Cubra o mouse com uma manta de aquecimento para evitar a hipotermia.

11. Aquisição de Imagens

O software de fonte aberta μManager (Vale Lab, UCSF) é usado para adquirir lapso de tempo imagens. Os dados são compilados em Imaris software (bitplane), e pode ser marcado manualmente por observadores independentes, ou analisados ​​em um ou outro software Imaris ou outra análise de imagem (por exemplo, Volocity [PerkinElmer] ou ImageJ [NIH]).

12 eutanásia.

No fim da sessão de imagem (1-40 horas, dependendo do tipo de processo de análise), o animal é sacrificado.

  1. A concentração de isoflurano é aumentada para 4%.
  2. O animal é observado até 30 segundos após a toma de respiração e, em seguida, removido do palco.
  3. Deslocamento cervical é realizada para assegurar que o animal foi sacrificado.

13. Resultados representativos

Imagiologia intravital com este método permite a visualização directa de diversos processos, incluindo a entrega de droga aos tumores, extravasamento e a distribuição da droga, uma vez que ele atinja o tumor, a morte das células após o tratamento terapêutico, e tumor do estroma-interações em resposta a morte celular 5. Para observar a chegada de um medicamento para o tumor e a sua distribuição na sequência de extravasamento nos tecidos tumorais, o animal é injectado enquanto as imagens são adquiridas. Apesar de várias classes de chemotherapeutics são fracamente fluorescente (tal como doxorrubicina), não são muitos. Dextranos fluorescentes conjugados podem ser usados ​​como marcadores substitutos para a entrega de drogas e de difusão para os tecidos. Figura 2 e Filme 1 mostra a chegada de um isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano conjugado 2 MD (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) injectado iv. em um tumor de um MMTV-PyMT; rato ACTB-ECFP.

Após a chegada do fármaco para dentro do tumor, extravasamento e difusão através dos tecidos pode ser trabalhada para determinar tanto o semi-vida intravascular de uma droga e droga de distribuição 5. 2 mostra o filme extravasamento e distribuição de Alexa Fluor-647-conjugado dextrano 10 kD (Invitrogen, 1 mg / ml em 1 x PBS) injectado iv. em C3 (1)-Tag; rato c-fms-EGFP durante imagiologia; ACTB-ECFP. Após a compilação de time-lapse filmes em Imaris (bitplane), a distribuição de meia-vida e drogas intravascular é quantificado. Para medir intravascular meia-vida, A intensidade média de fluorescência nos vasos sanguíneos do tumor, em cada ponto de tempo é calculado e representada graficamente em função do tempo. Distribuição de drogas é quantificado como uma percentagem de área por unidade de área total do tumor, que é positiva para a droga.

Além de controlar a cinética de distribuição de droga aos tumores, é frequentemente importante para determinar como os tumores estão a responder à terapia. Como terapias anti-câncer são esperados para induzir a morte celular, iodeto de propídio coloração (PI) ou estruturais alterações nucleares pode ser usado como um marcador de droga-induzida morte celular 5. Figura 3 mostra a resposta do tumor à doxorrubicina citotóxico quimioterapêutico numa MMTV -PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP mouse. Neste transgênico triplo MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal, ECFP rótulos células de câncer de mama (azul), e as células EGFP rótulos mielóides (verde). O animal fotografado durante esta sessão foi administrado doxorrubicina 18 horas antes de imagem começou e PI foi entregue ip todo tele sessão de imagem, como descrito acima. Células cancerosas (ACTB-ECFP rotulagem) aparecem como azul, e as células mortas ou a morrer aparecer como vermelho (coloração PI). A série temporal aqui apresentada mostra a indução de doxorrubicina-dependente a morte celular ao longo do tempo. Para quantificar a indução de morte celular nos tumores, o mesmo tipo de análise para a determinação da distribuição de droga é utilizado, onde a saída é quantitativa por cento por área de superfície total do tumor, que é positiva para o PI.

Imagiologia de alta ampliação pode fornecer informações sobre o tipo de morte celular que as células de cancro submetidos a 5. Filme 3 mostra os resultados de uma experiência de imagem para controlar as alterações nucleares típicas da morte celular por apoptose em resposta a um tratamento sistémico com doxorrubicina. Para visualizar os núcleos, o animal trabalhada durante esta sessão abriga o repórter ACTB-H2B-EGFP em vez do repórter c-fms-EGFP, para os núcleos de células cancerosas estão marcados a verde. Este MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animais ACTB-H2B-EGFP foi admdoxorrubicina inistered (8 mg / kg em 1 x PBS) ip 24 horas antes do início do filme, e receberam injecções por hora de 1 x PBS contendo PI (Invitrogen, 1 mg / ml de solução diluída 1:15). As alterações estruturais nos núcleos de células cancerosas pode ser observado em uma célula apoptótica lado de células que sofreram necrose (PI-positivas as células que exibem alterações mínimas na morfologia nuclear). Os núcleos de células apoptóticas, eventualmente torna-se vermelha, devido à absorção de coloração PI (não mostrado). O número de eventos de necrose e apoptose é quantificada manualmente para cada ponto de tempo com base em PI-positividade e morfologia nuclear.

Induzida pela quimioterapia do cancro morte celular frequentemente resulta num recrutamento reactivo de células imunes em tumores 2,4,5. A Figura 4 mostra um exemplo desta resposta do estroma para o tratamento agudo com doxorrubicina. O MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animais c-fms-EGFP trabalhada aqui foi administrado doxorubicina (8 mg / kg em 1 x PBS) ip . cerca de 20 horas antes do início da imagiologia, e receberam injecções ip de hora em hora PI. para o período de ensaio de visualizar a morte celular. Os tempos indicados representam o número de horas após o tratamento de doxorrubicina, e a barra de escala representa 100 fim. Nesta experiência, células mielóides infiltrar em zonas de morte celular, tal como indicado pelas setas brancas. Para quantificar a infiltração de células mielóides em tumores após a doxorrubicina administração, o mesmo tipo de análise para a determinação da distribuição de drogas e a resposta do tumor à quimioterapia é utilizada, em que a saída é quantitativa por cento por área de superfície total do tumor, que é positiva para EGFP.

Além de visualizar a resposta global do estroma para a quimioterapia, especializadas respostas do estroma pode também ser visualizado 5. Filme 4 mostra a fagocitose do material celular por necrose por uma célula vizinha. O material vermelho nuclear pode ser visto a ser ingerida por uma célula com um large núcleo intacto verde, que é típica dos macrófagos. O MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animais ACTB-H2B-EGFP trabalhada durante a sessão foi administrado doxorubicina (8 mg / kg em 1 x PBS) ip. 24 hr antes do início do filme. O animal recebeu injecções de horários de 1 x PBS contendo PI (Invitrogen, 1 mg / ml de solução diluída 1:15). Núcleos (ACTB-EGFP rotulagem) aparecem como verde, mas fica vermelho como a célula sofrer necrose.

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Figura 1. Rotulagem amostra de diferentes componentes tumorais usando rótulos transgênicos e injetáveis ​​Este é um triplo-transgênico MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal em que as células cancerosas são marcados em azul através da expressão do ECFP e células mielóides são rotulados em verde com a expressão de EGFP de um promotor específico mielóide. O animal foi injectado com iodeto de propídio (PI, vermelho, ~ 0,07 mg / ml em PBS 1x), durantea sessão de imagem a visualizar a morte celular. Rótulos de DNA PI, mas apenas atravessa as membranas celulares das células mortas ou a morrer. Barra de escala = 100 pm.

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Figura 2. Extravasamento e distribuição de drogas em tumores Este duplo transgénico MMTV-PyMT;. Animais ACTB-ECFP em que as células cancerosas são marcados em azul através da expressão de ECFP foi injectado com FITC-conjugado 2 MD dextrano (verde) durante a sessão de imagem a visualizar como drogas atingir os tumores após a injeção iv (azul). Tempo após imagiologia foi iniciado é indicado. Barra de escala = 100 pm.

figure-protocol-3
Figura 3. Resposta de células de câncer de terapia sistêmica. Uma MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal tratado com o quimioterapêuticodoxorrubicina droga antes da imagiologia, e injectados com PI (vermelho, ~ 0,07 mg / ml em PBS 1x) para rotular a morte celular. Esta série mostra a imagem de acumulação de coloração PI ao longo do tempo (como indicado pelas setas brancas), que representa a indução de células de tratamento doxorubicina após a morte. Tempo indicado é o tempo após o tratamento com doxorrubicina. As imagens são projeções de intensidade máxima de um z-stack, contendo três imagens no eixo z. Barra de escala = 100 pm.

figure-protocol-4
Figura 4. Resposta das células mielóides de quimioterapia em um MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;. Rato c-fms-EGFP triplo transgênico administrado doxorrubicina 20 horas antes da imagem O animal recebeu ip horária. injecções de PI (vermelho, ~ 0,07 mg / ml em PBS 1x) para rotular as células mortas. Esta série mostra a imagem de acumulação de células mielóides EGFP-positivas (como indicado pelas setas brancas) ao longo do tempo após doxorubitratamento cin. Esta resposta imunitária reactiva foi mostrado para impedir a resposta terapêutica para várias classes de quimioterapias 4,5. Tempo indicado é o tempo após o tratamento com doxorrubicina. As imagens são projeções de intensidade máxima de um z-stack, contendo três imagens no eixo z. Barra de escala = 100 pm.

Filme 1. . Entrega da droga em um tumor Este é um duplo-transgênico MMTV-PyMT; animais ACTB-ECFP em que as células cancerosas são marcados em azul através da expressão do ECFP. O animal foi injectado com um 2 MD FITC-dextrano conjugado (verde) durante a sessão de imagem a visualizar como drogas atingir tumores após injecção iv. Barra de escala = 100 mm. Clique aqui para ver filme .

Filme 2. Infiltração de droga no tecido tumoral A tripla transgénico C3 (1)-Tag,. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animal em que as células cancerosas são laBeled em azul através da expressão de ECFP e células mielóides marcados a verde através da expressão de EGFP foi injectado iv com um Fluor Alexa 647-conjugado dextrano 10 kD (vermelho). O campo de visão é mostrado imediatamente após a injecção com dextrano. O dextrano inicialmente rotula a vasculatura, rapidamente extravasates para o tecido do tumor, e é finalmente tomado pelos macrófagos. Barra de escala = 100 mm. Clique aqui para ver filme .

Filme 3. Imagiologia de alterações nucleares após quimioterapia morte celular induzida Este triplo transgénicos MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP animal foi injectado com doxorubicina antes da imagiologia. Morfologia nuclear (verde), como monitorado por expressão de uma proteína de fusão EGFP-H2B, permite a visualização directa da quimioterapia induzida por alterações estruturais nucleares típicas da apoptose, como visto para a célula no canto superior direito. A rece animaisived meia hora ip. injeções de PI (vermelho) para a duração da sessão de imagem para identificar as células mortas e morrer. Tempo indicado é o tempo após o tratamento com doxorrubicina 24 hr. As imagens foram obtidas utilizando uma lente objetiva de alta ampliação (40x, NA 1.1, lente de água). Barra de escala = 15 um. Clique aqui para ver filme .

Filme 4. Imagiologia de alterações nucleares e de absorção de material de células mortas após quimioterapia morte celular induzida por este transgénico triplo MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP animal foi injectado com doxorubicina antes da imagiologia. Morfologia nuclear (verde), como monitorado por expressão de uma proteína de fusão EGFP-H2B, permite a visualização directa da quimioterapia induzida por alterações estruturais nucleares. O animal recebeu a cada meia hora ip. injeções de PI (vermelho) para a duração da sessão de imagem para identificar as células mortas e morrer. As imagens foram adquiridasutilizando uma objectiva de grande ampliação (40 x, ​​1,1 de NA, da lente de água). A ausência de grandes alterações estruturais antes da marcação com PI e a mudança na morfologia nuclear e da perda de sinal de GFP é indicativa de necrose do tipo de morte celular. O material é considerado morto sendo tomada por uma célula com um grande núcleo, que é típica dos macrófagos. Tempo indicado é o tempo após o tratamento com doxorrubicina 24 hr. Barra de escala = 10 m. Clique aqui para ver filme .

Discussão

As respostas dos tumores aos tratamentos sistémicos in vivo pode ser dramaticamente diferentes das células cancerosas in vitro, como o microambiente influencia tanto a resposta aguda e recaída 5. Um dos maiores obstáculos para a explicitação das vias quimiorresistência Vivo é a complexidade das interações entre as células de câncer e seu microambiente. Em particular, porque os tumores sólidos têm desenvolvido um equilíbrio entre o cancro e as células do estroma, perturbações de um componente, como a morte celular que ocorre durante o tratamento anti-cancro, pode resultar em efeitos dramáticos na organização dos tecidos.

A técnica de imagem intravital fornecido aqui permite a visualização direta de câncer de células do estroma interações dentro dos tumores de ratos anestesiados ao vivo, durante o tratamento com drogas anti-câncer. Usamos microscopia confocal de disco giratório, que tem uma profundidade de penetração relativamente limitada (ver 17 ), mas as nossas técnicas cirúrgicas e rotulagem pode ser usado com outros tipos de microscopia. Filmes obtidos a partir destas experiências pode ser utilizada para controlar os processos, que incluem alterações na intensidade de fluorescência (por exemplo, devido à infiltração de uma população marcada ou indução da morte celular), motilidade celular, a distribuição de injectáveis ​​(por exemplo, para controlar derrame vascular), e co- localização dos sinais fluorescentes 5,12,17,20.

Rotineiramente ratos de imagem para mais de 6 horas e de imagem também realizada por mais de 18 horas. Isto requer a manutenção dos ratinhos continuamente sob anestesia para estes períodos de tempo longos. Com anestesia adequada, mais de 90% dos animais sobrevivem nossos 6 horas, e cerca de 80% sobrevivem mais de 18 horas. Detalhes sobre como realizar a longo prazo da anestesia foram publicados previamente 19. Em nossa experiência, cinco fatores são fundamentais: evitar a hipotermia, evitando a desidratação, mantendo fisiológicas no sangue os níveis de saturação de oxigênio, ucantar gás transportador umidificado pelo isoflurano, e manter os animais com o menor nível de anestesia em que eles não mostram sinais de dor. Para manter a temperatura do corpo, mantemos ratos sob um cobertor aquecido (38 ° C). Para evitar a desidratação, é injectar pequenos volumes de solução salina IP em todo o procedimento de imagem inteira. Para manter níveis fisiológicos de saturação de oxigénio do sangue, que começa com 21% de oxigénio no gás de transporte (em vez de a comummente utilizado a 100%). Isso nos permite aumentar os níveis de oxigênio inalado se um rato - hora em um experimento - mostra uma diminuição na saturação de oxigênio no sangue. Em nossa experiência, aumentando os níveis de oxigênio inalado em tempo tal (por exemplo, 30-40%), quase sempre irá estabilizar o animal permitindo horas de imagem adicional. O nível ideal de anestesia é para a maioria dos mouses alcançados com 1-1,5% isoflurano e resulta em taxas de respiração de 60-65/min e taxas de pulso de 400-450/min. Em nossos experimentos de imagem, utilizamos principalmente modelo de camundongo transgênicos (MMTV-PyMT e C3 [1]-Tag), no qual os tumores são multifocal, permitindo imagens de múltiplas lesões em diferentes fases da progressão do tumor, em paralelo em múltiplos, as posições x y durante uma sessão única imagem. Isto diminui as preocupações relativas rato para rato variação no que diz respeito a experiências destinadas a identificar fase dependentes de respostas terapêuticas, e reduz o número de animais necessários para a imagiologia.

O modelo de MMTV-PyMT (e outros modelos de cancro espontâneas) passam por fases progressivas histopatológicos que podem ser reconhecidos durante imagiologia intravital, embora o estadiamento patológico das lesões tumorais que podem ser feitas durante a imagiologia intravital é diferente de, e menos detalhado, do que a de cortes histológicos 5,17. Em contraste, os modelos de transplante de tumores tendem a reflectir melhor fase tardia, como as células cancerosas normalmente são isolados a partir de tumores avançados. Tais modelos são, assim, mais susceptíveis de estudar a tumores do estromainterações de tumores em estágio final que diferenças nessas interações entre diferentes etapas.

Nós mostramos exemplos de como a imagem nucleares alterações estruturais que ocorrem após a morte celular induzida por terapia. Na ausência de tratamento anti-cancro, esta estratégia de etiquetagem pode ser utilizado em vez da divisão celular de imagem in situ, elucidar, por exemplo, como proliferação celular e a dormência é influenciada pelo microambiente. No futuro, a marcação fluorescente de componentes mitocondriais pode tornar possível a mudança de imagem mitocondriais que ocorrem durante a morte celular por apoptose.

Neste protocolo, mostrámos também exemplos de como a imagem de cancro interacções célula-célula do sistema imunológico após a terapia, mas outros componentes do microambiente pode também ser visualizada e impressa. As linhas repórter transgênicos para os componentes do estroma incluem os de fibroblastos (por exemplo., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21), ou células da vasculatura (por exemplo, Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23).

Intravital de imagem permite a visualização em tempo real das interacções e processos que ocorrem na administração in vivo a seguir a quimioterapia. Com a tecnologia atualmente disponível, temos feito grandes progressos na compreensão de como as células mielóide influenciar a resposta terapêutica, no entanto, porque o microambiente do tumor é tão complexo, grandes avanços ainda são necessários para começar a mergulhar em mecanicamente os processos subjacentes ambiente mediado por resistência às drogas. Um dos avanços mais importantes ainda necessário é a identificação de melhores marcadores de populações de células específicas. A importância dos melhores marcadores é bem ilustrada com dois dos componentes mais importantes das células estromais do microambiente do tumor da mama, fibroblastos e células do sistema imune. α-actina de músculo liso (αSMA) é freqüentemente usado para identificarfibroblastos, mas a proteína também é expressa por células musculares lisas vasculares e células mioepiteliais 24. Assim, embora ratos αSMA-GFP repórter existir, determinar o tipo específico de célula estar abaixo durante um experimento de imagens intravital é desafiador. De modo semelhante, um único marcador fluorescente tal como expressa EGFP sob o promotor de c-fms, muitas vezes identificar múltiplas subpopulações de células imunes 12,17. Assim, embora um Prefere utilizar um único marcador para identificar um tipo específico de célula a complexidade da biologia subjacente representa um grande desafio na utilização desta abordagem.

Uma solução parcial para este problema é a utilização de etiquetas de injectáveis ​​para diferenciar ainda mais sub-populações de células que expressam o mesmo repórter fluorescente. Por exemplo, os dextranos fluorescentes são captados por macrófagos e podem ser usados ​​para marcar as subpopulações de macrófagos que são etiquetados pelo c-fms-EGFP e Fsp1-EGFP ratinhos transgénicos repórter 17. Os anticorpos conjugados de sondas fluorescentes também têm sido utilizados para identificar subpopulações específicas (por exemplo, a população Gr1-positivo de células mielóides rotulados pelo repórter c-fms-EGFP 17).

Diferentemente das curvas de resposta do tumor gerados pelo compasso de calibre de medição, o qual fornece informações mecanicista pouco sobre como ou por tumores respondem à terapêutica administrada, ou a série histológica derivadas de tecidos colhidos em momentos diferentes, que necessitam de grandes grupos de animais, a nossa técnica fornece informação directa quantificável sobre a dinâmica da morte celular e as interações de células do estroma com células cancerosas em pequenas coortes. Assim, a vantagem de utilizar o processo descrito aqui, é que ela fornece uma informação dinâmica sobre as respostas de drogas no contexto de um microambiente do tumor intacto, em tempo real. Tal informação pode levar a importantes insights sobre os processos subjacentes que impulsionam respostas terapêuticas 5 </ Sup>.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar. Todas as experiências com animais foram conduzidos de acordo com os protocolos aprovados IACUC.

Agradecimentos

Agradecemos J. e J. Cappellani Qiu para suporte técnico. Este trabalho foi financiado por fundos do Instituto Nacional do Câncer (U01 CA141451), o Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for the Cure, Long Island Caminhada dia 2 de Combate ao Câncer de Mama, Manhasset Coalizão das Mulheres Contra o Câncer de Mama para mim, e um pré-doutoramento bolsa de estudos do Programa Dirigido pelo Congresso Breast Cancer Research, dos EUA para ESNESN também é o destinatário da C. Leslie rápida e William Randolph Hearst bolsas da Fundação da Faculdade de Ciências Biológicas Watson. HAA foi apoiada por fundos do Conselho de Pesquisa da Noruega (160698/V40 e 151882), e Sudeste Autoridades Regionais de Saúde (2.007.060).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagente
MMTV-PyMT ratos Jackson Laboratory 2374
C3 (1)-Tag ratos Jackson Laboratory 13591
ACTB-ECFP ratos Jackson Laboratory 3773
ACTB-H2B-EGFP ratos Jackson Laboratory 5418
1 x PBS Feita em casa
2 MD Dextran, fluoresceína conjugada Invitrogen D-7137 Reconstituir em dH 2 O (4 loja mg / ml, à temperatura de -20 ° C); diluído a 1 mg / ml em 1 x PBS
Dextran 10 kD, Alexa Fluor 647-conjugados Invitrogen D-22914 Reconstituir em dH 2 O (4 loja mg / ml, à temperatura de -20 ° C); diluído a 1 mg / ml em 1 x PBS
Cloridrato de doxorrubicina Sigma-Aldrich 44583 Reconstituir em dH2O e armazenar a 4 ° C; diluir em 1 x PBS
Isothesia (isoflurano) Butler Abastecimento Saúde Animal 029450 250 ml
Iodeto de propídio Invitrogen P3566 1 mg / ml; diluído 1:15 em 1 x PBS
Nitrogênio
Oxigênio
Equipamento
18G x 1 ½ "agulha de bisel regulares BD 305196
μManager Vale Lab, UCSF www.micro-manager.org Software de código aberto
Algodão embebido em álcool BD 326895 Compressas com álcool isopropílico a 70%
Sistema de anestesia Moleculares Imaging Products Co.,
Tampa de vidro Corning 2940-245 No. 1 ½, mm 24x50; desinfectar com 70% toalhetes isopropanol
Gurança esponjas de gaze (esterilizada) Kendall 6939
Lâminas de vidro de microscópio Corning 2948-75x25 Pré-limpeza, se não pré-limpeza, desinfecção com 70% toalhetes isopropanol
Endurecidos tesoura fina Belas Science Tools 14090-11 2 pares; aço inoxidável, afiado afiadas pontas, ponta reta, 26 vanguarda mm, 11 cm de comprimento
Cobertor aquecido Gaymar Indústrias
Hot talão esterilizador Belas Science Tools 18000-45 Transformar em cerca de 30 min antes da sua utilização; esterilizar instrumentos a> 200 ° C durante 30 seg
Imaris Bitplane www.bitplane.com
Krazy Glue Produtos Elmer KG484
Laboratório de fita (½ ")
Fita Laboratory (1 ")
A tampaum refrigerador de isopor transporte Isto será utilizado como plataforma cirúrgica
Micro pinça de dissecação Roboz RS-5153 Dentes 1x2, curva ligeira, 0,8 de largura ponta 4 mm, comprimento "
Micro pinça de dissecação Roboz RS-5135 Serrilhada, ligeira curva, 0,8 de largura ponta mm; 4 de comprimento "
Microscópio Spinning-disco confocal, XYZ fase Piezo, capablility epifluourescence 17,25
Inserção do microscópio Aplicada Instrumentação Científica Personalizado fabricado, com duas portas de imagens circulares
MouseOx oxímetro, software e sensores STARR Ciências da Vida www.starrlifesciences.com
Nalgene Super Versi-Dry laboratório soakers Thermo Scientific 74218-00 Corte em quartos para alinhar plataforma cirúrgica
Nebulizador Salter Labs 8901 Usado para umidificar gases; evita a irritação dos tecidos pulmonares
Deslizamento ponta de seringa de tuberculina descartável (1 ml) BD 309659
Surflo conjunto infusão alado Terumo SV-23BLK 23G x ¾ "agulha ultrafina, 12" tubo
Betadine spray Purdue Pharma BASP3H

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