Artigo de método

Eletroporação do rombencéfalo rastrear Trajetórias axonal e Metas Synaptic no embrião de galinha

DOI:

10.3791/50136

⸱

29 de maio de 2013

 ,  ,  , 
1Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Medical Neurobiology, The Hebrew University of Jerusalem

Neste artigo

Resumo

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Como as redes neuronais são estabelecidas no cérebro embrionário é uma questão fundamental no desenvolvimento da neurobiologia. Aqui nós combinamos uma técnica de eletroporação com novas ferramentas genéticas, como Cre / Lox-plasmídeos e sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada no hindbrain aviária para rotular interneurons dorsal e rastrear suas projeções axonais e metas sinápticas em diferentes estágios de desenvolvimento.

Resumo

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A electroporação do tubo neural embrionário pintainho tem muitas vantagens, tais como ser rápido e eficiente para a expressão de genes estranhos em células neuronais. Neste artigo, procuramos fornecer um método que demonstra unicamente como electroporate DNA no hindbrain aviária em E2.75, a fim de marcar especificamente um subconjunto de células progenitoras neuronais, e como seguir suas projeções axonais e metas sinápticas em estágios muito avançados de desenvolvimento, até E14.5. Utilizamos ferramentas genéticas novas, incluindo elementos específicos do realçador, Cre / Lox - plasmídeos base e do sistema de transposição de DNA PiggyBac mediada para dirigir a expressão GFP em um subtipo de células rombencéfalo (o dorsal mais subgrupo de interneurônios, da1). Trajetórias e metas da da1 axônios axonal são seguidas em fases embrionárias precoces e tardias em várias regiões do tronco cerebral. Esta estratégia contribui com técnicas avançadas para as células de interesse alvo na parte posterior do cérebro embrionário e para tracing formação circuito em vários estágios de desenvolvimento.

Introdução

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A parte posterior do cérebro representa um cubo do relé-chave do sistema nervoso por meio da comunicação entre os sistemas nervosos central e periférico via ascendente e descendente redes neuronais. Ele regula as funções básicas, incluindo respiração, consciência, audição e coordenação motora 1-3. Durante o desenvolvimento embrionário inicial, a parte posterior do cérebro dos vertebrados é transitoriamente subdividida ao longo do eixo ântero-posterior (AP) em rhombomeres repetitivas, em que os tipos de células neuronais distintas são formadas e gerar múltiplos centros de núcleos do tronco cerebral 4. A parte posterior do cérebro também é dividido ao longo do seu eixo dorsal-ventral (DV) em uma placa basal e alar, em que os progenitores neuronais discretas e diferenciar-se especificadas em locais distintos 3,5,6 DV. Como o início da AP e DV específicos padrões neuronais estão governando o estabelecimento de circuitos do tronco cerebral funcional é em grande parte desconhecido.

Para adquirir conhecimentos sobre esta fundamentaisquestão, são necessárias ferramentas, a fim de rotular subconjuntos específicos de neurônios no cérebro posterior cedo e traçar suas trajetórias axonal e conectividade em estágios mais avançados. Nós já utilizou elementos de melhoria específica, e um sistema de expressão condicional Cre / baseado LoxP para acompanhar a trajetória axonal de interneurônios da coluna dorsal no embrião de galinha cedo 7-9. No manuscrito atual que têm como alvo o cérebro posterior e atualizado o paradigma experimental para a rotulagem final interneurons rombencéfalo embrionárias, axônios e seus alvos sinápticas, usando uma estratégia de eletroporação modificado eo PiggyBac - Transposição DNA mediada. A nossa nova estratégia permite a marcação de subtipos neuronais distintas em um dos lados da parte posterior do cérebro e a localização dos seus locais de projecções axonais e sinápticos em vários estádios de desenvolvimento embrionário, a partir de 2 até 12 dias após a electroporação. Com base neste método, que classificou o dorsal, mais subgrupo de interneurons rombencéfalo (dA1/Atoh1 + células) e revelou dois padrões de projeção axonal ascendentes contralateral, cada um deriva de um local AP diferente e alonga em um funículo distinta. da1 axônios foram encontrados para projeto e sinapses formulário em núcleos auditivos, mesencéfalo e em múltiplas camadas do cerebelo 10.

A combinação de garota eletroporação, rastreamento genético de neurônios e análise de locais de projeção em estágios muito avançados de desenvolvimento fornece uma plataforma única de estudar a formação de redes neuronais no cérebro e para elucidar os mecanismos moleculares que governam a formação de circuitos.

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Protocolo

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1. Eletroporação hindbrain

1.1 manuseio Egg

  1. Colocar os ovos horizontalmente numa incubadora humidificada (37-38,5 ° C). Os embriões são electroporados após 65-70 horas de incubação, quando atingem 16-17 (HH) fase (25-30 somites).
  2. Retire os ovos da incubadora, eles permanecem na posição horizontal.

1.2 Preparações

  1. Puxar capilares de vidro (0,5 mm de diâmetro).
  2. Ligação dobrados em forma de L Genetrodes eléctrodos de ouro (diâmetro 3 mm) com uma placa de suporte para o gerador de impulsos. Parâmetros eletroporação incluem 25 volts, 5 números de pulso, 45 ms de comprimento de pulso, 300 intervalos de pulso ms.
  3. Prepara-se uma pipeta de boca, agulha de seringa de 10 ml, as tiras de parafilme, uma escova macia, dissecando tesoura afiada e 25 ml de solução de PBS estéril. Esta quantidade é suficiente para lidar com uma bandeja de ovos (18 ovos).
  4. Prepara-se uma mistura adequada de plasmídeos de ADN (5 mg / mL de cada) eadicionar cerca de corante Verde Rápido 0,025% para visualizar a injecção de ADN. Normalmente, um volume de 4 ul é suficiente para a injecção de um tabuleiro.

1.3 de janelas, Injeção e Eletroporação

  1. Limpe as cascas de ovos com etanol 70%.
  2. Lidar com um ovo de cada vez para minimizar o tempo de exposição ao ar embrionário.
  3. Fazer um buraco no pólo ovo com as tesouras de pontas e remover 3-4 ml de albumina com a seringa. Não remova a maior quantidade de albumina, uma vez que reduz a viabilidade.
  4. Abra uma pequena janela oval (2,5 x 2 cm de tamanho) na parte central superior da casca do ovo usando a tesoura de dissecação.
  5. Gotejamento algumas gotas de PBS em cima do embrião para evitar a secura durante todo o processo.
  6. Coloque uma pequena quantidade da mistura de ADN no capilar de vidro usando uma pipeta de boca.
  7. Coloque o embrião com a extremidade posterior em direção a você. Sem injeção de tinta é necessária nesta fase, o embrião é claramente visível. Evitar um aumento de injeção de tintasobrevivência embrionária. Penetrar o hindbrain caudal mantendo o capilar em ~ 45 °. Não retire nenhuma membrana ao redor do embrião. Injetar solução de DNA com cuidado para a luz hindbrain e expire sem formar bolhas de ar. Solução de ADN espalha anteriormente.
  8. Imediatamente após a injeção de DNA, coloque os eletrodos paralelos no AP precisa e DV posição hindbrain você apontar para o alvo. Empurrar os eléctrodos ligeiramente ventralmente sem tocar no coração, em que pode reduzir a viabilidade. Pulsar o electroporator. Os eléctrodos deverão ser cobertas com bolhas para indicar condutividade elétrica (Figura 1A).
  9. Cuidadosamente retire os eletrodos e pingar algumas gotas de PBS para esfriar o embrião e para remover as bolhas. Selar o ovo abrir corretamente com uma tira de parafilme para evitar o ressecamento durante a incubação. Lavar eléctrodos em PBS com o pincel macio.
  10. Coloque ovos na incubadora para o período de tempo desejado. A sobrevivência de embriões de aproximadamente 90% depois de 2-3 diaselectroporação, e reduz-se para 50% de 12 dias após a electroporação.

2. Análise de Embriões

2.1 Preparação e imunofluorescência plano de montagem

  1. Preparações plano de montagem da parte posterior do cérebro podem ser realizadas até E6.5 para visualizar facilmente axônios sob um microscópio ou um estéreo-microscópio.
  2. Dissecar o embrião cuidadosamente separando-a de membranas que envolvem e vasos sanguíneos. Colocar o embrião num pequeno silicone - revestido placa de Petri contendo PBS. Conecte o embrião para o prato com pinos de tungstênio enfrentam dorsal. Realize uma fenda dorsal na parte posterior do cérebro telhado placa usando sharp capilares de vidro.
  3. Usando pinças afiadas e micro-tesouras segurar a parte superior da cabeça e puxe o tecido hindbrain com muito cuidado a partir de rostral para caudal. Após separação da rombencéfalo remover restantes tecidos ventrais para alcançar uma preparação limpa.
  4. Incubar a hindbrain com 4Solução% paraformaldeído (PFA) por 1-2 horas em temperatura ambiente (RT). Lava-se a parte posterior do cérebro com PBT (PBS/0.1% de Triton X-100) para remover a PFA.
  5. Para imunofluorescência em hindbrains plana montados adicionar 500 ul de solução de bloqueio (5% de soro de cabra em PBT e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente com um anticorpo Incubar r ON a 4 ° C. A lavagem com PBT (15 minutos x 3). Incubar 2 nd com anticorpo durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com PBT (15 minutos x 3).
  6. Colocar o rombencéfalo virada dorsalmente numa lâmina de vidro. Adicione meios de montagem fluorescentes na parte posterior do cérebro. Use capilares de vidro ou agulhas de tungstênio para achatar a hindbrain no slide.
  7. Adicionar pequena quantidade de massa lubrificante, em cada canto para impedir a compressão do tecido por a lamela de cobertura. Cuidadosamente coloque uma cobertura de vidro na parte superior da parte posterior do cérebro e evitar bolhas de ar. Para adesão adicionar unha polonês para cobrir as bordas de vidro.

2.2 Cryo-seções e Imunofluorescência

  1. Cryo-seções do tronco cerebral can ser realizada em qualquer fase de visualizar trajectórias axonais. No entanto, depois de E6.5 este deve ser o método preferido, devido à dificuldade em visualizar os axônios no embrião fixa-montado, que se torna demasiado espessa. Além disso, a manifestação de sinapses requer o seccionamento do tecido e uma vista de alta ampliação com um microscópio.
  2. Dissecar o embrião e remover todos os tecidos circundantes. Lavar com PBS. Corte o embrião na parte caudal da medula usando micro-tesouras e pinças afiadas. Fazer uma ampla incisão entre o cerebelo eo mesencéfalo e remover todo o tronco cerebral. O tecido deve conter a medula, ponte e cerebelo.
  3. Fixar o tronco cerebral em PFA a 4% durante a noite (ON) a 4 ° C, lavar com PBS (10 minutos x 3), e incubar com 30% de sacarose para LIGADO, a 4 ° C até afundamento.
  4. Incorporar o rombencéfalo num molde de crio com outubro (temperatura óptima de corte) de composto, e colocá-lo a -20 ° C, até o congelamento, conforme descrito noutro local 11.
  5. Coloque o bloco outubro no criostato no eixo transversal desejado. Largura da seção é de 12 mM.
  6. Seque as lâminas. Adicionar 100 ul de solução de bloqueamento em cada lâmina, durante 2 horas à temperatura ambiente. Adicionar 100 ul de anticorpos (diluído em solução de bloqueio à concentração desejada). O período de incubação para a 1 ª e 2 ª anticorpos está ligado a 4 ° C ou 2 horas à temperatura ambiente, respectivamente. Para cada tempo de incubação, adicionar suavemente parafilme tira na parte superior da corrediça para evitar a secura. Lavar com PBS (10 minutos x 3) entre os anticorpos. Se for necessário, adicionar 1:1000 Dapi (4'-6-diamidino-2-fenilindole), diluiu-se em PBS durante 20 min à TA. Lavar com PBS.
  7. Montar o slide com meios de montagem fluorescentes. Deixe secar por 1 hora antes da análise.

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Resultados

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Este protocolo foi usado recentemente para descobrir os padrões axonal e locais de projeção de da1 subgrupo de interneurônios na garota hindbrain 10. Para identificar especificamente esses axónios, um elemento potenciador (Atoh1), que tenha sido previamente caracterizadas como específico para neurónios espinais ED1 8,12,13, foi confirmado para ser expresso em células rombencéfalo da1 10. O elemento foi clonado a montante Cre recombinase e co-electroporados em E2.75 juntamente com uma Cre...

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Discussão

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Na eletroporação in ovo é uma ferramenta viável, confiável e eficaz para examinar especificação celular e orientação axonal durante garota desenvolvimento do sistema nervoso 20. Neste protocolo, descrevemos um modo de eletroporação na hindbrain garota em E2.75 usando elementos potenciador que permitem a rotulagem condicional de interneurons específicas. Esta estratégia é combinada com o sistema de transposição PiggyBac mediada para inserir genes estranhos no genoma do pintinho, que permite o...

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dr. Yuval Gottlieb-Dror para a ilustração eletroporação. Este trabalho foi financiado por doações para DSD do Instituto Nacional de Psicobiologia em Israel e para o programa de cooperação Research Niedersachsen-Israel e por subvenções a AK da Fundação Israel Ciência, o Ministério da Saúde de Israel, e O Centro do Património Excellence-Legacy parceria Ciências Biomédicas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Genetrodes de ouro em forma de L Eletrodos de 3 mmBTX, Harvard Apparatus45-0162
gerador de pulso, ECM 830BTX, Harvard Apparatus45-0002
OCT (Temperatura de Corte Ideal) CompostoTissue-TekSakura 4583 O.C.T. Esmalte Composto
de Qualquer Fornecedor Comercial

Referências

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