Ex Vivo Blood Red Ensaio Hemólise celular de Avaliação de pH-responsivos agentes Endosomolytic para entrega citosólico de Drogas Biomacromolecular

Resumo

Um ensaio de hemólise podem ser usados ​​como um meio rápido, tela de alto rendimento de cytocompatibility sistemas de entrega de drogas e atividade endosomolytic para entrega intracelular de carga. O ensaio mede a ruptura das membranas dos eritrócitos em função do pH do meio ambiente.

Resumo

Bicamadas de fosfolipídios que formam endo-lisossômico vesículas podem representar uma barreira para a entrega de medicamentos biológicos para alvos intracelulares. Para ultrapassar esta barreira, uma série de transportadores de drogas sintéticas têm sido desenvolvidos para a perturbação activa da membrana endossomal e entregar a carga para dentro do citoplasma. Aqui, nós descrevemos o ensaio de hemólise, a qual pode ser usada como uma rápida, tela de alto rendimento para a actividade e cytocompatibility endosomolytic de sistemas de entrega de drogas intracelulares.

No ensaio de hemólise, as células vermelhas do sangue e os materiais de teste são co-incubados em tampões a pHs definidos que imitam extracelulares, cedo endossomais e lisossomais tarde endo-ambientes. Após um passo de centrifugação a pelota intactas as células vermelhas do sangue, a quantidade de hemoglobina libertada para o meio é medida por espectrofotometria (405 nm para melhor a gama dinâmica). A interrupção por cento de glóbulos vermelhos é então quantificada em relação ao controle positivo samples lisadas com detergente. Neste sistema modelo da membrana do eritrócito serve como um substituto para a membrana de camada dupla de lípido que encerram endo-lisossomais vesículas. O resultado desejado é a hemólise insignificante a um pH fisiológico (7,4) e hemólise robusto na gama de pH a partir de endo-lisossomal aproximadamente pH 5-6,8.

Introdução

Embora existam muitos potenciais de alto impacto alvos terapêuticos no interior da célula, a entrega intracelular de agentes representa um desafio significativo. Frequentemente, as drogas, especialmente produtos biológicos, são internalizados pelas células e de tráfico dentro de vesículas que, ou levar a uma degradação do seu conteúdo através da via endo-lisossomal, ou são transportados de volta para fora da célula através de exocitose. ¹ No último processo, o pH interno das vesículas é acidificada para cerca de 5-6, que é o pH óptimo para a actividade das enzimas que funcionam neste compartimento, tal como a lisozima ^2.

Protocolo

1. Preparação e Esterilização de Buffers e agentes de teste

1. 150 mM de NaCl: Dissolver 4,383 g de cristais de NaCl em 500 ml de água nanopura.
2. Os tampões de pH: Preparar tampão fosfato a pH 5,6, 6,2, 6,8, e 7,4 por mistura de quantidades apropriadas de fosfato monobásico e fosfato de sódio dibásico. Se as amostras são testadas a valores de pH mais baixos (isto é, pH <5,6), em seguida, um tampão mais apropriado, tal como tampão de citrato, deve ser usado. Receitas tampão estão facilmente disponíveis, e um exemplo de referência tenha sido fornecido aqui ^12.
3. Esterilizar todos os buffers acima indicadas através de um apar....

Resultados

Tipicamente, os agentes que exibem um comportamento dependente do pH ideal hemolítica têm o maior potencial para a entrega de drogas citosólica, ácidos nucleicos ou outras moléculas bioactivas. Isto é exemplificado pelo agente # 1, como mostrado na Figura 2, o qual exibe a hemólise mínima a um pH de 7,4, mas um aumento significativo no comportamento hemolítica em gamas de pH endossomais (<6,5). Alguns agentes podem exibir níveis significativos de comportamento hemolítica em gamas de pH fisiológ.......

Discussão

pH-responsivos polímeros ou outros agentes destinados a função endosomolytic pode ser rápida e eficazmente rastreados com base na lise de células vermelhas do sangue em valores de pH encontrados no endossoma (Figura 1, pH 6,8 - endossomo precoce, a pH 6,2 - endossoma tardio, pH 5,6 - lisossoma). ^14-17 hemólise dependente do pH foi usado para analisar a capacidade de mediar a libertação transportadoras endossomal da terapêutica biomacromolecular péptidos (por exemplo, siRNA, ODNs, pro.......

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubos	Fisher Scientific	22-253-145	Para coleta de sangue
BD Vacutainer sangue agulhas para coleta, 20,5 calibre-	Fisher Scientific	02-665-31	Para coleta de sangue
BD Vacutainer Tubo Adaptador Titular / Agulha	Fisher Scientific	22-289-953	Para coleta de sangue
BD Marca álcool isopropílico Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	Para coleta de sangue
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Para coleta de sangue
Ácido clorídrico (cone.)	Fisher Scientific	A144-500	Para o ajuste do pH de D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Controle positivo
PBS Dulbecco	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 estéril Unidade de frascos de filtro descartável com SFCA Membrana	Fisher Scientific	09-740 44A-
BD placas de 96 poços, de fundo chato de poliestireno tecido, a cultura tratada com	Fisher Scientific	08-772 2C-	Por placa de leitura no final do ensaio.
BD placas de 96 poços, de fundo redondo de poliestireno de tecido, a cultura tratada com	Fisher Scientific	08-772-17	Por incubação de células vermelhas do sangue com agentes experimentais.