Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Resumo

Um protocolo para a análise de nanopartículas de seguimento (NTA) e de alto rendimento de citometria de fluxo para avaliar as nanopartículas poliméricas entrega de genes é descrito. NTA é utilizada para caracterizar a distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas e a distribuição de partículas por plasmídeo. De alto rendimento de citometria de fluxo permite a avaliação da eficácia de transfecção quantitativo para uma biblioteca de biomateriais de entrega de genes.

Resumo

Non-viral de entrega de genes utilizando nanopartículas poliméricas emergiu como uma abordagem atraente para a terapia de gene para tratar ^uma doença genética e como uma tecnologia para a medicina regenerativa ^2. Ao contrário dos vírus, que têm problemas de segurança significativos, as nanopartículas de polímeros pode ser concebido para ser não-tóxico, não-imunogénicas, não mutagénica, mais fáceis de sintetizar quimicamente versátil, capaz de transportar cargas maiores de ácidos nucleicos e biodegradável e / ou ambientalmente sensíveis. Os polímeros catiónicos auto-montar com o DNA carregado negativamente pela interacção electrostática, para formar os complexos da ordem de 100 nm, que são normalmente chamados de nanopartículas poliméricas. Exemplos de biomateriais usados ​​para formar nanopartículas nanoescala de entrega de genes policatiónicos incluem polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoaminas) s e polietilenoimina (PEI), que é um não-degradável off-the-shelf polímero catiónico vulgarmente utilizados para a entrega de ácidos nucleicos ^1,3. Poli (beta-aminoéster) s (PBAEs) são uma nova classe de polímeros catiónicos que sejam ⁴ hidroliticamente degradável ^5,6 e têm-se mostrado eficazes na entrega de genes em tipos de difícil transfectam de células, tais como células endoteliais humanas da retina (HRECs) ^7, células epiteliais mamárias de rato ^8, células cerebrais humanas cancerosas ⁹ e macrovasculares (veia umbilical humana, HUVECs) células endoteliais ^10.

Um novo protocolo para a caracterização de nanopartículas poliméricas utilizando análise de nanopartículas de rastreamento (NTA) é descrito. Nesta abordagem, tanto a distribuição do tamanho de partícula e da distribuição do número de plasmídeos por partícula são obtidos ^11. Além disso, um alto rendimento de ensaio de transfecção placa de 96 poços para rastreio rápido da eficácia de transfecção de nanopartículas poliméricas é apresentado. Neste protocolo, o poli (beta-amino éster) s (PBAEs) são utilizados como polímeros de modelo e da retina humana (células endoteliais HRECs) são utilizados como model células humanas. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para avaliar qualquer nanopartícula de polímero e de qualquer tipo de células de interesse num formato de placa de multi-poços.

Introdução

A determinação do número de plasmídeos complexados por nanopartículas é importante desenhar eficazes de nanopartículas à base de estratégias de distribuição de genes, em particular para co-entrega de plasmídeos múltiplos para a mesma célula-alvo, tal como muitas vezes é necessário reprogramar os estudos de células estaminais ^12. Algumas abordagens para calcular o número de plasmídeos associados com uma nanopartícula única têm sido descritos, e cada método tem desvantagens das técnicas usadas para a estimativa de ^13-16. Quantum dot rotulagem (QD), combinada com MET foi utilizada para estimar os plasmídeos por partícula de quitosano baseada em nanopartículas. Estimativa com esta técnica QD é complicado devido à necessidade de rotular o DNA, o que pode alterar as suas propriedades de auto-montagem, a possibilidade de que o DNA não marcado encapsulado não é directamente detectada; plasmídeos potencialmente sobrepostos e QDs nas imagens de TEM 2D de partículas, e outras hipóteses simplificadoras ^13. Uma abordagem alternativa, que é umAPLICÁVEL microdomínios quando ordenados existir nas partículas tem sido usado para estudar lipopoliamina-DNA por meio de complexos de crio-microscopia electrónica de transmissão (Cryo-TEM), dispersão de raios X e dispersão dinâmica de luz (DLS) ^14,15. Infelizmente, os materiais, tais como as nanopartículas de polímeros investigados aqui, não são aplicáveis ​​a este método. . Em outro estudo, Collins et al utilizaram um fluxo de partículas técnica de análise de imagem para o estudo (Lys) ₁₆ contendo peptídeos / DNA complexos, no entanto, o seu método só pode avaliar maiores, micron de tamanho de partículas ^16. Assim, foi recentemente desenvolvido um ensaio de novo e flexível para quantificar o número de plasmídeos por nanopartículas de ^11.

Protocolo

1. Sementeira celular

1. Não permitir que as células a crescer para overconfluency. Usar células de passagem iniciais, quando a transfecção de células primárias.
2. Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células Tripsinizar, contar as células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão de células com meio para atingir a densidade celular desejada (células / volume). Células de sementes para cultura de tecidos clara-tratado de fundo plano de 96 poços, utilizando um reservatório e pipetas multicanal. A densidade escolhida deve dar 70-80% de confluência no dia da transfecção. Por exemplo, como exibido na Tabela 1, as células foram diluídas para 25 a 50 células / ul para os dados de transfecção mostradas aqui.

2. A transfecção de células

1. Diluição do polímero e os estoques de DNA. Descongelar polímero e soluções de reserva de ADN, à temperatura ambiente (RT). Diluir solução-mãe de polímero e solução de ADN, de uma forma clara separadamente placas de 96 poços, utilizando uma pipeta de 12 canais, Com o solvente apropriado para as concentrações necessárias para obter o peso de polímero desejada para razões de ADN de peso (p / p). Neste caso, o solvente escolhido é de 25 mM de tampão de acetato de sódio (pH = 5,2).
   1. DNA de diluição. Tipicamente, o DNA armazenado a 1 mg / ml é diluída em tampão de acetato de sódio a uma concentração de 0,03 a 0,06 mg / ml de uma forma clara não-tecido de cultura tratada placa de 96 poços (um bem para uma única formulação). Tabela 2 mostra o protocolo de diluição típico de DNA para uma única formulação usada para transfectar quatro cavidades replicadas em uma placa de 96 poços com células a partir do Passo 1.
   2. Diluição do polímero. A solução de 100 mg / ml de polímero / DMSO é diluído em tampão de acetato de sódio de acordo com a concentração necessária para obter o desejado polímero de DNA proporção peso / peso. A gama de peso / peso rácios tipicamente utilizados para a entrega de genes com poli (beta-amino éster) s (PBAEs) é de 20 a 100. Polímeros PBAE são primeiro diluídos para 10 mg / ml, seguido de diluição do protocolo como mostrado na Tabela 3. As diluições de polímero pode ser realizada de uma forma clara não-tecido de cultura tratada placa de 96 poços, que corresponde à orientação da amostra da placa de diluição do DNA.
2. Formação de nanopartículas. Adicionar a solução PBAE a um volume igual da solução de DNA de plasmídeo utilizando uma pipeta de 12 canais e misturar vigorosamente. Deixe a mistura incubar à temperatura ambiente durante 10 min para permitir a auto-montagem.
3. Transfecção de nanopartículas. Na sequência de auto-montagem, a 20 ul de nanopartículas são adicionados por poço de meio de cultura, gota a gota com a pipeta 12 de canal. Cavidades replicadas são deixados sem tratamento, ou são transfectados com reagentes disponíveis comercialmente, como controles. As células transfectadas foram incubadas a 37 ° C durante duas a quatro horas e, em seguida, os poços são substituídos por meios frescos (100 ul / poço). A escolha do tempo de incubação depende da linha celular, as condições de cultura, e um sistema de transfecção. A diferença de transfecçãoeficácia e toxicidade celular como um resultado de variação período de incubação será quantificado pelo protocolo de análise descrito no Passo 3.

3. Análise da eficácia de transfecção e toxicidade celular

A eficiência de transfecção é analisada visualmente com um microscópio de fluorescência e quantificada utilizando um citómetro de fluxo de 48 horas após a transfecção. Toxicidade celular é analisada visualmente com um microscópio de fluorescência e quantificada utilizando o ensaio CellTiter 96 One aquosa 24 horas após a transfecção.

1. A microscopia de fluorescência. Analisar visualmente os poços durante a expressão do gene repórter transfectadas (por exemplo, EGFP ou DsRed) utilizando o canal apropriado fluorescência. Aquisição de imagens para cada poço, a escolha de campos de visão que representam adequadamente a eficiência de transfecção para as formulações particulares (Figura 1). Faça uma nota de qualquer toxicidade celular observado visualmente.
2. Citometria de Fluxo.
   1. Use pipetas multicanal para preparar a placa de 96 poços por citometria de fluxo. Lavar com PBS, Tripsinizar com 30 ul / poço de tripsina / EDTA, neutralizar com 170 ul de tampão de FACS (PBS + 2% FBS), pipeta-se para baixo e, em cada poço, incluindo à volta dos rebordos, e transferir o volume de 200 uL, de todo cada poço em poços correspondentes de uma ou de fundo redondo de fundo em V-placa de 96 poços.
   2. Centrifugar a placa a 130 xg durante 5 min a 4 ° C.
   3. Remover 170 ul de meio de cada poço e as células pipeta para ressuspender, evitando bolhas de ar. Para utilizar uma mancha de viabilidade, como iodeto de propídio (PI), adicionam-se 10 ul de tampão FACS + PI (50:1 tampão FACS: PI de diluição; PI concentração estoque de 1 mg / ml) a cada poço. Colocar imediatamente em gelo e cobrir de luz.
   4. Comece o C6 citômetro de fluxo Accuri, o HyperCyt de 96 poços anexo, eo software HyperView. Use HyperView Design e guias Protocolo de escolher o adequado pTipo de tarde, layout da placa e outras configurações como trepidação / SIP / lavar / agitar tempo. Para o protocolo acima, os parâmetros que se seguem foram usados, um primeiro prato de pré-, durante um minuto, e um batido de chapa pré-, durante 30 segundos a 2400 rpm. Tempo gole foi marcada para 15 segundos a 15 rpm, uma sonda enxaguar bem para cada 2 segundos, e uma inter-agitar bem a cada 12 poços para 12 segundos a 2.400 rpm. A vibração da inter-bem é importante manter as células dispersas nos meios de comunicação, bem como para a melhor capacidade de processamento dos dados, incluindo quebras temporizadas, entre grupos de cavidades (neste caso, 12 seg).
   5. Use HyperView guia Identificação Bem para processar os dados e separados, para o bem apropriado (Figura 2). A fim de identificar os poços individuais, ele pode ajudar a usar filtro do software de ruído, bem como incluindo uma base mesmo filtro sob as configurações avançadas.
   6. Quantificar percentual de positivamente transfectadas células vivas pela passagem apropriada para separar pop diferenteulations (Figura 3). Primeiro visualizar os dados de fluxo de um gráfico de dispersão FSC vs SSC, a fim de separar as células de detritos (Figura 3A). Se iodeto de propídio (PI) foi usado, porta a população de células individuais e vista que os dados sobre uma trama FSC vs FL3 de modo a separar as células vivas a partir de células mortas e as células vivas de porta. A fim de quantificar o número de células transfectadas, ver a população de células vivas nos canais apropriados, por exemplo, a GFP pode ser visto em FL1. Usando a população não tratada, portão as células não tratadas, a fim de identificar o sinal de fundo (Figura 3B). As células transfectadas de forma positiva pode então ser isolado usando este portão e exibindo as populações transfectadas utilizando tanto dispersão e gráficos de contorno (Figura 3C e 3D). Pode haver uma série contínua de células transfectadas de forma positiva, como células de diferentes serão transfectados para graus diferentes de fluorescência.
3. CellTiter 96 Um ensaio aquoso
   1. Transfectar uma outra placa, exactamente da mesma maneira que para as medições da toxicidade celular.
   2. Ml de pré-mistura de 96 1 de solução aquosa de ensaio CellTiter One com 10 ml de meio fresco. Remover media a partir de células e usar uma pipeta multicanal para adicionar 110 ul da solução de pré-mistura media + por poço.
   3. Medir a absorvância a 490 nm a cada intervalo de uma hora, 1-4 horas até que a absorvância do poço com a condição sem tratamento está no intervalo linear do ensaio. Incluem quatro poços de controlo com a mídia única solução + para uma leitura absorvância de fundo.
   4. Valores médios da absorbância dos quatro poços repetições por condição e subtrair a absorvância de fundo média de cada média. Normalizar a média corrigida para cada condição de tratamento com a média corrigida da condição sem tratamento para determinar a viabilidade celular por cento.

_title "> 4 Nanoparticle. Dimensionamento com NTA e Plasmideo Cálculos partícula por

1. Primeiro sistema de fluidos do NS500 NanoSight por uma bomba de diluente para a frente em aproximadamente 1/5th a velocidade máxima ea bomba de amostra para trás em aproximadamente 1/10th a velocidade máx. Continue até que o sistema de fluidos é lavada com o diluente.
2. Prepare as nanopartículas para serem analisados. No caso de PBAEs, separadamente diluir o DNA plasmídeo estoque (1 mg / ml) e estoque PBAE (100 mg / ml) em tampão de acetato de sódio (25 mM, pH 5), em tubos de Eppendorf.
3. Dilui-se a concentração de DNA plasmídico a 0,06 mg / ml. Concentração do polímero pode variar de acordo com a proporção de peso-peso de polímero necessária para ADN (por exemplo, por 60 wt / wt partículas, o polímero é diluído para 3,6 mg / ml).
4. Adicionar a solução de polímero a um volume igual da solução de DNA de plasmídeo e misturar vigorosamente. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 10 min para permitir a auto-montagem.
5. Dilute a solução de nanopartículas de 100 vezes em PBS para que a concentração das nanopartículas para estar no intervalo apropriado para NTA e para se obter um volume final de, pelo menos, 500 uL.
6. Carregar a amostra no NanoSight colocando o tubo de carregamento dentro da amostra de tubo Eppendorf (Figura 4A). Certifique-se de não introduzir bolhas de ar.
7. No modo de captura, aumentar o nível da câmara até que as partículas podem ser vistas. Ajustar o foco, de modo que as partículas de aparência suave (Figura 4A e 4B).
8. Enquanto no modo padrão, ajustar o nível da câmara para além do ponto de que todas as partículas podem ser vistas no ecrã. Em seguida, diminui o nível da câmara para o nível mais baixo de tal modo que as partículas podem ainda ser observadas. Se um nível de câmera intermediário é necessário, entrar em modo avançado e modificar o obturador da câmera e ganhar para os níveis adequados.
9. Visualmente verifique se há entre 20 - 100 partículas no screen. Um número ideal para o rastreamento de nanopartículas é de aproximadamente 50 partículas. Se há muitos ou poucos, lave o NS500, ajustar a diluição em PBS, e re-carregar a amostra.
10. Ajuste a duração da captura de acordo com a tabela de modo standard. Tipicamente 30 - 60 seg é um comprimento de captura apropriado (Figura 4B).
11. Para carregar a amostra seguinte, lave o sistema, em seguida, voltar a carregar a amostra nova.
12. Uma vez que os vídeos são capturados, avançar para a fase de processamento, abrindo um arquivo de vídeo.
13. Há um número de parâmetros que pode ser ajustado a fim de melhor processar um vídeo (Figura 4C). O objectivo consiste em seleccionar os parâmetros que melhor capturar todas as partículas sobre a tela, conforme indicado por uma marca de cruz vermelha na tela sobre cada partícula (Figura 5).
14. Aumentar o ganho de tela para ver melhor as partículas. Sob o modo padrão ou avançado, selecione o ajuste automático para os parâmetros por clicking caixas apropriadas. No caso em que as configurações de auto não adequadamente selecionar partículas, desmarque a caixa e definir manualmente os parâmetros (Figura 4C).
15. Uma vez que todas as partículas são colhidos na tela, clique no botão de processo do software para processar o arquivo de vídeo (Figura 4C). Isto fornece a distribuição do tamanho das partículas, a média de tamanho, assim como a concentração de partículas.
16. A fim de assegurar que a concentração de partículas é exacta, alterar a diluição PBS, tal como através do aumento da diluição em 2x, e repetir o procedimento acima. Medindo diluições múltiplas de uma mesma amostra é recomendado para assegurar que a medição da concentração da amostra é precisa. Uma boa variedade de medição é 10 ⁷ -10 ⁹ partículas / ml.
17. Verificar se todos os plasmídeos são incorporados em nanopartículas por electroforese em gel de execução das nanopartículas e avaliar se qualquer DNA livre está presente.Se nem todos os plasmídeos são encapsulados, utilizar técnicas padrão para medir a absorvância de DNA a fim de quantificar o total plasmídeos encapsulados.
18. Para calcular o número médio de partículas por plasmídeos, dividir a concentração total de plasmídeo encapsulado pela concentração de partículas medido NTA. A fim de estimar a distribuição da amostra de plasmídeo por partícula, da primeira utilização do NTA histograma de tamanho de partícula para calcular a fracção de volume de cada compartimento de 1 nm de partículas. Multiplicar esta fracção de volume de distribuição pela quantidade total de plasmídeo para obter o número de plasmídeos em cada compartimento. Dividir estes números por o número de partículas em cada compartimento para obter o número de plasmídeos a partículas por cada tamanho de partícula (Figura 6).

Resultados

A Figura 1 mostra uma imagem de microscopia de fluorescência de um exemplo de uma transfecção bem sucedida de HRECs com o plasmídeo EGFP. A imagem de campo claro é útil para assegurar que as células mantêm a sua morfologia normal. Além disso, os ensaios de viabilidade celular, tais como ensaios de MTS ou semelhantes, pode ser utilizado para avaliar a toxicidade das nanopartículas ^7. A citometria de fluxo, tal como descrito, pode ser utilizado para quantificar a eficiência da transfecção. Ao u...

Discussão

Os protocolos acima descrevem métodos para avaliar a eficácia de transfecção de formulações de nanopartículas, bem como uma maneira de caracterizar o tamanho de partícula e carga de DNA das nanopartículas. O número de plasmídeos por partícula é um parâmetro importante que pode ajudar a prever a eficácia da partícula e pode também ser usado para a determinação de dose. Análise de rastreamento de nanopartículas pode ser realizado em uma variedade de diferentes soluções aquosas, tais como os que diferem em concentração de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			Reagente
Tampão fosfato salino, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Tripsina	Invitrogen	25300
De tampão de acetato de sódio	Sigma-Aldrich	S7899	Diluir a 25 mM em água desionizada
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP DNA	Biopharmaceuticals Elim	NA
DNA DsRed	Addgene	21718
PEI, ramificado	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter aquosa 96 Um	Promega	G3580
			Materiais
Fundo plano claro placa de 96 poços, estéril	Sarstedt	82.1581.001
Fundo redondo clara placa de 96 poços, estéril	Sarstedt	82.1582.001
12 canais Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 e 50-300 ul
Microscópio de fluorescência	Zeiss	NA	Número do Modelo: AX10
C6 citômetro de fluxo Accuri	BD Biosciences	NA
Anexo HyperCyt	Intellicyt	NA
NS500	NanoSight	NA