Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Resumo

Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.

Resumo

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital e novas abordagens terapêuticas que podem reduzir a recorrência ea progressão são necessários. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do tumor e a resposta terapia. Por conseguinte, é muitas vezes desejável para crescer as células de tumor no órgão a partir do qual se originou. Este protocolo descreve um modelo ortotópico de cancro de bexiga, em que as células de carcinoma de bexiga de murino MB49 são instilada na bexiga através do cateterismo. Implantação de células de tumor bem sucedida, neste modelo requer a interrupção da camada de glicosaminoglicano de protecção, que pode ser realizada por meios físicos ou químicos. No nosso protocolo da bexiga é tratada com tripsina antes da instilação de células. Cateterização da bexiga podem também ser usados ​​para entregar agentes terapêuticos uma vez que os tumores estão estabelecidos. Este protocolo descreve o fornecimento de uma construção adenoviral que expressa um gene repórter da luciferase. Enquanto our protocolo foi otimizado para estudos de curto prazo e se concentra na entrega gene, a metodologia de rato cateterismo vesical tem amplas aplicações.

Introdução

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos e 15.000 mortes esperadas em 2012 ^1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida requerem acompanhamento, o que faz com que o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. Cancro da bexiga que invadiu a camada muscular podem metastizar para o fígado, o pulmão ou o osso através do sistema linfático. Terapia Multimodal de tumores avançados resultados em apenas 20-40% de sobrevida após 5 anos. Portanto, as estratégias de tratamento eficazes destinadas a reduzir a recorrência ea progressão do câncer superficial da bexiga, bem como melhorar....

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisadas e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Medical University of South Carolina. O protocolo foi aprovado sob USDA categoria D para a dor.

1. Implantação celular

1. Dois dias antes de realizar o procedimento, placa 1 x 10 ⁶ MB49 células em frascos T-25. Use alta DMEM glucose suplementado com 10% FBS (e antibióticos, se desejar). Um frasco é suficiente para cada grupo de até cinco ratinhos que serão anestesiados e implantado em paralelo.
2. No dia do procedimento, preparam tripsina para instilação diluindo estéril de 0,25% de grau de c....

Resultados

Hematúria é observado em quase todos os ratos num período de 8 dias após a implantação de 200.000 células MB49. Como mostrado na Figura 1, o peso da bexiga mais do que duplica de 34,7 ± 3,3 mg (gama 31-37 mg, n = 4) não tumorais em ratinhos portadores de 87,5 ± 19,2 mg (gama de 77-120 mg, n = 10) em ratinhos que foram implantados com células MB49. Em termos de entrega de genes, descobrimos que imagiologia ratinhos 24 horas após a instilação viral produz um sinal mais forte do que depois de 48 horas

Discussão

A metodologia principal descrito neste protocolo é o cateterismo de bexigas de rato, que tem amplas aplicações para a instilação de células ou qualquer agente destinado para entrega local para o epitélio da bexiga. O protocolo específico descrito acima foi otimizado para estudos de curto prazo (~ 10 dias). Implantar o número exato de células é fundamental, uma vez que um número de células maior resultará em crescimento do tumor e, possivelmente, mais rápida perda de animais devido a grande carga tumoral. Usando 200.000 .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos fêmeas de 6-8 semanas	Jackson Laboratories	Nome da cepa: C57BL/6J Número de estoque: 000664
Tripsina*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtido através de Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtido através de Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	InactivatedHeat-inactivated
T25 frascos*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtido através de células Fisher
MB49	N/A	N/A	Obtido do Dr. Boehle (ver referência11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtido através da Fisher
Creme depilatório: Veet	farmácia local
Lubrificante: K-Y Jelly	farmácia local
Cateteres*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtido através de Fisher
Isoflurano	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtido através de
seringas TB de ponta deslizante de 1 ml de ponta deslizante	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferina	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Solicite amplificação em larga escala e purificação de CsCl para uso in vivo	Agente infeccioso que requer contenção BSL2
Steady-Glo  Sistema de ensaio de luciferase	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) ou E2550 (10 x 100 ml)
*disponível através de vários fornecedores
EQUIPAMENTO
Sistema de anestesia	Sistemas EZ, Euthanex Corporation	Sistema de anestesia: EZ7000 5 portas Dispositivo de reinalação de camundongo: EZ109	Obtido através da Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2