Um modelo de cancro da bexiga para Ortotópico Gene Estudos de entrega

Resumo

Implantação de células cancerosas para o órgão de origem pode servir como um modelo pré-clínico útil para avaliar novas terapias. Células de carcinoma da bexiga MB49 pode ser cultivada no interior da bexiga, após a instilação intravesical. Este protocolo demonstra a cateterização da bexiga do rato com a finalidade de implantação do tumor e entrega adenoviral.

Resumo

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital e novas abordagens terapêuticas que podem reduzir a recorrência ea progressão são necessários. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do tumor e a resposta terapia. Por conseguinte, é muitas vezes desejável para crescer as células de tumor no órgão a partir do qual se originou. Este protocolo descreve um modelo ortotópico de cancro de bexiga, em que as células de carcinoma de bexiga de murino MB49 são instilada na bexiga através do cateterismo. Implantação de células de tumor bem sucedida, neste modelo requer a interrupção da camada de glicosaminoglicano de protecção, que pode ser realizada por meios físicos ou químicos. No nosso protocolo da bexiga é tratada com tripsina antes da instilação de células. Cateterização da bexiga podem também ser usados ​​para entregar agentes terapêuticos uma vez que os tumores estão estabelecidos. Este protocolo descreve o fornecimento de uma construção adenoviral que expressa um gene repórter da luciferase. Enquanto our protocolo foi otimizado para estudos de curto prazo e se concentra na entrega gene, a metodologia de rato cateterismo vesical tem amplas aplicações.

Introdução

O câncer de bexiga é o segundo tipo de câncer mais comum do trato urogenital, com cerca de 75.000 novos casos e 15.000 mortes esperadas em 2012 ^1. As altas taxas de recorrência ao longo da vida requerem acompanhamento, o que faz com que o câncer de bexiga um dos cancros mais caras para tratar. Cancro da bexiga que invadiu a camada muscular podem metastizar para o fígado, o pulmão ou o osso através do sistema linfático. Terapia Multimodal de tumores avançados resultados em apenas 20-40% de sobrevida após 5 anos. Portanto, as estratégias de tratamento eficazes destinadas a reduzir a recorrência ea progressão do câncer superficial da bexiga, bem como melhorar os resultados terapêuticos em pacientes com doença avançada são urgentemente necessários.

Desenvolvimento de novas terapias requer modelos pré-clínicos para avaliar a eficácia após a avaliação inicial in vitro. O microambiente do tumor pode influenciar significativamente o desenvolvimento do câncer e capacidade de resposta, o que evidencia a necessidade de pré-clínicosal modelos em que os tumores surgem ou pode ser estabelecido no órgão de origem. Uma das abordagens é o desenvolvimento de modelos transgénicos em que os tumores surgem espontaneamente ou pode ser induzida de uma forma específica do órgão. Um excelente protocolo de um modelo de câncer de bexiga transgênico foi recentemente publicado ^2. A desvantagem de modelos transgénicos é que os tumores tendem a desenvolver-se lentamente e com menos uniformidade do que o desejado. Além disso, o custo de manutenção de uma colónia de reprodução tem de ser considerado. Uma alternativa aos modelos transgénicos é o implante ortotópico de células tumorais, o que tem a vantagem de prazos curtos para o estabelecimento do tumor em ratinhos disponíveis comercialmente. Enquanto algumas linhas celulares de cancro da bexiga humano pode ser cultivado ortotopicamente (temos utilizado com sucesso UM-UC-3), pode ser desejável estabelecer tumores em ratinhos imunocompetentes. Duas linhas celulares de cancro da bexiga murino, que crescem ortotopicamente são MBT-2 e MB49 ^3. Desde MBT-2 células estão contaminados com replicandotipo C retrovírus ^4, escolhemos MB49 células para os nossos estudos. É importante notar que a MB49 células foram isoladas a partir de um rato macho e implantes ortotópicos são por razões anatómicas realizados em ratos fêmeas. Este tem a vantagem de facilitar a identificação das células implantadas por meio de marcadores do cromossomo Y, mas a incompatibilidade de gênero pode ser um inconveniente para os estudos imunológicos.

O epitélio da bexiga é revestida por um (GAG) da camada de glicosaminoglicano, o qual funciona como uma barreira para a infecção por micro-organismos. Esta barreira também pode interferir com a implantação de células tumorais e de vários métodos têm sido desenvolvidos para superar esta dificuldade (Tabela 1). Eletrocautério tem sido amplamente utilizado como um meio físico para romper a camada de GAG ^5-13 e um eletrocautério demonstrando protocolo foi recentemente publicado na Jove ^14. No entanto, se uma unidade de electrocautério não estar disponível, meios químicos para destruir o GAG camada tais como nitrato de prata, ou poli-L-lisina também pode ser utilizada ^15-24. Os tumores são estabelecidos de forma eficaz através de uma breve exposição da bexiga a um pequeno volume de nitrato de prata (5-10 ul, 0,15-1,0 M, ~ 10 seg) ou mais, o contacto com poli-L-lisina (100 ul de 0,1 mg / ml durante 20 min) (Tabela 1). Aqui, descrevemos um método que utiliza a tripsina para facilitar a implantação de células MB49.

Em uma tentativa de melhorar as abordagens terapêuticas para o câncer de bexiga, a terapia gênica tem atraído atenção significativa. De um ponto de vista clínico, o cancro da bexiga é um alvo ideal para terapia génica devido ao fácil acesso do órgão e a capacidade para distribuir localmente a carga útil. Os vetores virais que foram exploradas para a terapia genética câncer de bexiga incluem um vírus herpes simplex oncolítico ^{25, 26} retrovírus, vírus de canários ^27, o vírus vaccinia, AAV, e adenovirus ^28. Na segunda parte do nosso protocolo, que descrevem um método para a entrega viral que é virtualmente idêntico ao da instilação das células tumorais. De interesse no nosso laboratório é o desenvolvimento de novas abordagens para a entrega do gene, que avaliam através bioluminescência, utilizando um vector adenoviral que expressa um transgene da luciferase. No entanto, a metodologia de cateterização da bexiga pode ser utilizada para a entrega dos vários agentes e, portanto, tem ampla aplicabilidade.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram revisadas e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Medical University of South Carolina. O protocolo foi aprovado sob USDA categoria D para a dor.

1. Implantação celular

1. Dois dias antes de realizar o procedimento, placa 1 x 10 ⁶ MB49 células em frascos T-25. Use alta DMEM glucose suplementado com 10% FBS (e antibióticos, se desejar). Um frasco é suficiente para cada grupo de até cinco ratinhos que serão anestesiados e implantado em paralelo.
2. No dia do procedimento, preparam tripsina para instilação diluindo estéril de 0,25% de grau de cultura de tecidos com tripsina a 0,125% com um meio base de DMEM estéril (diluição de 1:2). 1,2 ml é suficiente para 10 ratinhos. Colocar num banho de água a 37 ° C para equilibrar.
3. Pré-aquecer uma almofada de aquecimento e posicioná-lo de acordo com as nosecones do sistema de anestesia que vão ser utilizados para entregar isoflurane. Coloque um pano absorvente limpo sobre a almofada de aquecimento.
4. Coloque ratos na câmara de indução de anestesia e o sistema de induzir a anestesia com 3% de isoflurano. Quando os ratos perderam a consciência, o que é verificado pela perda do reflexo toe-pitada, transferi-los para os nosecones. Certifique-se que cada animal está em decúbito dorsal e devidamente colocado sobre a almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal.
5. Reduzir a concentração de isoflurano a 2% para manutenção da anestesia.
6. Aplicar pomada oftálmica para ambos os olhos para evitar a secagem.
7. Etapa opcional: Remover cabelo abdominal. Cabelo na parte inferior do abdome deve ser removido se in vivo bioluminescente de imagem será realizado.
   1. Aplique uma camada generosa de creme depilatório, como Veet, para o menor em um quadrado de pele no abdômen, tomando cuidado para não entrar em contato com a genitália externa. Espere 3 min.
   2. Remova o cabelo esfregando a área com uma esponja seca, em seguida, usar uma esponja úmida para limpar a pele. Repetir uma vez, se necessário.
8. Cateterizar a bexiga
   1. Lubrifique um novo estéril 24 G cateter venoso, pediátrica com um gel lubrificante não irritante, como KY. Remova e descarte a agulha. Em caso de fuga de líquido ao redor do cateter é um problema comum, ie. que ocorre com mais frequência do que em um dos dez ratinhos, cateteres furo maior (20 g) pode ser utilizado. Esta pode ser uma consideração importante em ratos mais velhos do que 8 semanas.
   2. Segurando o hub do cateter, use o polegar eo dedo indicador de sua mão oposta para espalhar as pernas traseiras do mouse e expor o meato uretral. Inserir suavemente o cateter na uretra de um ângulo de 45 °, a alteração do ângulo de um paralelo com o banco para inseri-la totalmente.
   3. Após a inserção completa, levantar o cateter suavemente, mantendo-o paralelamente à bancada, e confirmar visualmente que é colocada na uretra e não a vagina, o que é abaixo. Se correctamente colocado, o cateter irá ser capaz de estar emtotalmente inserida desde a vagina é mais curta do que a uretra.
   4. Reduzir a concentração de isoflurano a 1%.
9. Anexar uma ponta de uma pipeta de P200 e remover a urina da bexiga através da aplicação de sucção à extremidade externa do cateter. Remova qualquer urina restante do hub do cateter. Descarte urina e deixar cateter no lugar.
10. Pipetagem cuidadosa de 80 mL uma solução de tripsina a 0,125% para o cubo do cateter, evitando bolhas de ar. Anexar uma seringa cheia de ar de 1 ml para o cubo de cateter e deprimir o êmbolo devagar 0,1-0,2 mL para entregar a tripsina na bexiga.
11. Deixar a seringa e conjunto de cateter no lugar, durante 15 min. Repita os passos 1,8-1,11 por qualquer um dos restantes ratinhos anestesiados (até 4). Vá para a próxima etapa, durante o período de espera. DICA: Inicialmente, pode ser útil ter alguém para preparar as células (passo 1.12).
12. Prepare células MB49 para a implantação. As células foram plaqueadas a 1 x 10 ⁶ por T-25 frascos de 48 horas antes da implantação (passo 1.1).
    1. Retirar mídia e adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina para o balão. Quando as células destacar adicionar 5 ml de DMEM completo para ressuspender as células. Retirar uma aliquota de 50 ul de contagem, e centrifugar o restante a 1.000 rpm durante 5 min. Durante a fase de centrifugação continuar a passos 1.12.2 e 1.12.3.
    2. Contar as células usando um hemocitômetro. Calcular as células / ml. Em seguida o cálculo do volume necessário para trazer o sedimento celular a 4 x 10 ⁶ células / ml (2 x 10 ⁵ células por 50 pi).
    3. Decantar o sobrenadante das células centrifugadas e ressuspender o sedimento em meio base de DMEM com o volume necessário para suspender as células de 4 x 10 ⁶ células / ml (como calculado na etapa 1.12.2). Manter as células à temperatura ambiente.
13. Quando o ponto de tempo de 15 minutos para o tratamento de tripsina de bexigas é atingido, retirar a seringa cheia de ar a partir do cateter deixando o cateter no lugar. Tripsina gasto vai normaisly fluir de volta para fora através do cateter. Remova qualquer tripsina restante da bexiga por meio de sucção com a pipeta P200 como no passo 1.9 acima e descarte.
14. Imediatamente pipeta 50 ul de suspensão de células MB49 para dentro do cubo de cateter. Fixe a seringa de 1 ml cheia de ar para o hub do cateter e entregar as células da bexiga, pressionando lentamente o êmbolo 0,1-0,2 ml. Repetir esta etapa até quatro vezes adicionais para a implantação todos os cinco ratinhos. Descartar todas as células não utilizadas.
15. Deixando o conjunto do cateter-seringa no lugar, permitir que as células para habitar na bexiga durante 50 min.
16. Delicadamente, retire o conjunto do cateter-seringa da uretra. Vire a concentração de isoflurano a zero e mover cada rato uma ou duas polegadas de distância da nosecone recuperar na almofada de aquecimento.
17. Quando um rato recuperou o seu reflexo de endireitamento, devolvê-lo à sua jaula.

2. Entrega Intravesical de Adenovírus (8 dias após a implantação de células)

ATENÇÃO: Esta parte do protocolo usa o adenovírus, que é um agente infeccioso e deve ser tratado sob as diretrizes rigorosas BSL2 (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Todos os procedimentos realizados com agentes infecciosos foram aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional da Medical University of South Carolina.

1. Oito dias após a implantação de camundongos com células MB49, verifique se há hematúria. Pegar animais individuais ao longo de um pedaço de papel branco absorvente e pressione suavemente sobre o abdome para apagar gotas de urina para o papel. A urina que é cor de rosa ao vermelho indica hematúria e é um sinal de que os tumores têm estabelecido. Taxa de absorção do tumor é pelo menos 80% e com uma excelente técnica pode ser tão elevada como 100%.
2. Descongelar estoque adenoviral sobre gelo e dilui-se para 10 ⁹ PFU/50 ul (2 x 10 ¹⁰ UFP / ml) em estéril, PBS temperatura ambiente.
3. Anestesiar ratos, tal como descrito nos passos acima 1,3-1,6.
4. Cateterizar ratinhos, tal como descrito nas etapas 1.8 e remover a urina como no passo 1.9
5. Depois de urina é retirada, imediatamente pipeta 50 ul de suspensão de vírus, para dentro do cubo de cateter. Anexar a 1 ml da seringa cheia de ar para o centro do cateter e entregar o vírus de bexiga, pressionando o êmbolo devagar 0,1-0,2 ml.
6. Deixando o conjunto do cateter-seringa no lugar, permitir que o vírus para habitar na bexiga durante 40 min.
7. Delicadamente, retire o conjunto do cateter-seringa da uretra, e descartar a solução de água sanitária a 10% para inativar os vírus restante.
8. Vire a concentração de isoflurano a zero e mover cada rato uma ou duas polegadas de distância da nosecone recuperar na almofada de aquecimento.
9. Quando um rato recuperou o seu reflexo de endireitamento, devolvê-lo à sua jaula.
10. Marcar gaiolas para indicar que os ratos têm sido incutido com adenovírus. Vírus será derramado na cama gaiola por vários dias e todas as gaiolas e roupas de cama devem sermanuseados e desinfectados adequadamente.

Resultados

Hematúria é observado em quase todos os ratos num período de 8 dias após a implantação de 200.000 células MB49. Como mostrado na Figura 1, o peso da bexiga mais do que duplica de 34,7 ± 3,3 mg (gama 31-37 mg, n = 4) não tumorais em ratinhos portadores de 87,5 ± 19,2 mg (gama de 77-120 mg, n = 10) em ratinhos que foram implantados com células MB49. Em termos de entrega de genes, descobrimos que imagiologia ratinhos 24 horas após a instilação viral produz um sinal mais forte do que depois de 48 horas

Discussão

A metodologia principal descrito neste protocolo é o cateterismo de bexigas de rato, que tem amplas aplicações para a instilação de células ou qualquer agente destinado para entrega local para o epitélio da bexiga. O protocolo específico descrito acima foi otimizado para estudos de curto prazo (~ 10 dias). Implantar o número exato de células é fundamental, uma vez que um número de células maior resultará em crescimento do tumor e, possivelmente, mais rápida perda de animais devido a grande carga tumoral. Usando 200.000 ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Camundongos fêmeas de 6-8 semanas	Jackson Laboratories	Nome da cepa: C57BL/6J Número de estoque: 000664
Tripsina*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtido através de Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtido através de Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	InactivatedHeat-inactivated
T25 frascos*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtido através de células Fisher
MB49	N/A	N/A	Obtido do Dr. Boehle (ver referência11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtido através da Fisher
Creme depilatório: Veet	farmácia local
Lubrificante: K-Y Jelly	farmácia local
Cateteres*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtido através de Fisher
Isoflurano	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtido através de
seringas TB de ponta deslizante de 1 ml de ponta deslizante	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferina	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Solicite amplificação em larga escala e purificação de CsCl para uso in vivo	Agente infeccioso que requer contenção BSL2
Steady-Glo  Sistema de ensaio de luciferase	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) ou E2550 (10 x 100 ml)
*disponível através de vários fornecedores
EQUIPAMENTO
Sistema de anestesia	Sistemas EZ, Euthanex Corporation	Sistema de anestesia: EZ7000 5 portas Dispositivo de reinalação de camundongo: EZ109	Obtido através da Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2