Eletroporação Zona Neonatal subventricular

Summary

Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais neurais

Abstract

As células estaminais neurais (NSC) linha dos ventrículos laterais pós-natais e dão origem a vários tipos de células que incluem neurónios, astrócitos e células ependimais ^1. Entender os caminhos moleculares responsáveis ​​pela NSC auto-renovação, compromisso e diferenciação é fundamental para aproveitar o seu potencial único para reparar o cérebro e entender melhor sistema nervoso central. Os métodos anteriores para a manipulação de sistemas de mamíferos necessário o esforço demorado e caro de engenharia genética a nível animal inteiro ^2. Assim, a grande maioria dos estudos têm explorado as funções de moléculas NSC in vitro ou in invertebrados.

Aqui, nós demonstrar a técnica simples e rápida para manipular NPCs neonatais que é referido como neonatal eletroporação subventricular zona (SVZ). Técnicas semelhantes foram desenvolvidos há uma década para estudar NSCs embrionárias e ajudaram estudos sobre Cortical desenvolvimento ^3,4. Mais recentemente, esta foi utilizada para estudar o prosencéfalo roedor pós-natal ^5-7. Esta técnica resulta em rotulagem robusto de SVZ NSCs e seus descendentes. Assim, pós-natal SVZ electroporação proporciona uma alternativa de custo e de tempo eficaz para a engenharia genética de mamíferos NSC.

Protocol

Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Yale IACUC. Os cientistas devem se certificar de que as orientações IACUC são aprovados e seguido de acordo com as suas necessidades institucionais.

1. Seção 1. Preparação do Pipetas de DNA, Soluções e vidro

1. Gerar alta pureza (OD 260/280> 1,80) elevada concentração (ug / uL> 2,5) endotoxinas sem DNA.
2. Preparar solução salina 0,9% e filtrar através de um filtro estéril uM 22.
3. Colocar 10 centímetros de fogo polidas tubos capilares de vidro de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) em um modelo de PP-830 PC-10 Narishige pipeta de vidro com um puxador de....

Results

Neonatal resulta zona subventricular electroporação na rotulagem de quase todos glia radial contígua com a zona subventricular dorsal, dorsal lateral, e o movimento lateral, seguindo "varrer" do eléctrodo de pinça (Figura 1E). No entanto, a electroporação pode ser adaptado para as necessidades do respectivo ensaio, mas não varrer o eléctrodo e utilizando a colocação e orientação específica, conforme detalhado no vídeo. Por exemplo, uma vez localizada dorsalmente glia radial diferem daqueles revestimento.......

Discussion

Aqui nós detalhe a técnica de electroporação SVZ neonatal, uma técnica para rapidamente e de forma robusta e rotular manipular as células-tronco SVZ e seus descendentes. Há várias vantagens que tem a electroporação, em comparação com outras técnicas. Em primeiro lugar, dada a marcação focal de células, é capaz de discernir celulares autónomos e não autónomos efeitos célula. Manipulação, segundo genética utilizando sistemas indutíveis permite comparar o efeito antes ou após integração sináptica. Além disso, pode-se evita.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Tubulação Polido pesado borosilicato	Instrumento Sutter	BF150-110-10
Dual-Stage Vidro Micropipeta Puller	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Praça da onda de pulso gerador	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fibra Óptica Fonte de Luz	Fisher Scientific	12-562-36
Halogênio de tungstêniolâmpada	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instruments	052-0312-900