Artigo de método

Eletroporação Zona Neonatal subventricular

DOI:

10.3791/50197

⸱

11 de fevereiro de 2013

 ,  , 
1Department of Neurosurgery and Cellular & Molecular Physiology, Yale University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Nós demonstramos uma técnica minimamente invasiva referido como eletroporação zona neonatal subventricular. A técnica consiste em injectar o DNA de plasmídeo nos ventrículos laterais de bebés recém-nascidos e na aplicação de corrente eléctrica para fornecer e manipular geneticamente as células estaminais neurais

Resumo

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As células estaminais neurais (NSC) linha dos ventrículos laterais pós-natais e dão origem a vários tipos de células que incluem neurónios, astrócitos e células ependimais 1. Entender os caminhos moleculares responsáveis ​​pela NSC auto-renovação, compromisso e diferenciação é fundamental para aproveitar o seu potencial único para reparar o cérebro e entender melhor sistema nervoso central. Os métodos anteriores para a manipulação de sistemas de mamíferos necessário o esforço demorado e caro de engenharia genética a nível animal inteiro 2. Assim, a grande maioria dos estudos têm explorado as funções de moléculas NSC in vitro ou in invertebrados.

Aqui, nós demonstrar a técnica simples e rápida para manipular NPCs neonatais que é referido como neonatal eletroporação subventricular zona (SVZ). Técnicas semelhantes foram desenvolvidos há uma década para estudar NSCs embrionárias e ajudaram estudos sobre Cortical desenvolvimento 3,4. Mais recentemente, esta foi utilizada para estudar o prosencéfalo roedor pós-natal 5-7. Esta técnica resulta em rotulagem robusto de SVZ NSCs e seus descendentes. Assim, pós-natal SVZ electroporação proporciona uma alternativa de custo e de tempo eficaz para a engenharia genética de mamíferos NSC.

Protocolo

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Este procedimento está em conformidade com os requisitos de Yale IACUC. Os cientistas devem se certificar de que as orientações IACUC são aprovados e seguido de acordo com as suas necessidades institucionais.

1. Seção 1. Preparação do Pipetas de DNA, Soluções e vidro

  1. Gerar alta pureza (OD 260/280> 1,80) elevada concentração (ug / uL> 2,5) endotoxinas sem DNA.
  2. Preparar solução salina 0,9% e filtrar através de um filtro estéril uM 22.
  3. Colocar 10 centímetros de fogo polidas tubos capilares de vidro de borosilicato (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) em um modelo de PP-830 PC-10 Narishige pipeta de vidro com um puxador de....

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Resultados

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Neonatal resulta zona subventricular electroporação na rotulagem de quase todos glia radial contígua com a zona subventricular dorsal, dorsal lateral, e o movimento lateral, seguindo "varrer" do eléctrodo de pinça (Figura 1E). No entanto, a electroporação pode ser adaptado para as necessidades do respectivo ensaio, mas não varrer o eléctrodo e utilizando a colocação e orientação específica, conforme detalhado no vídeo. Por exemplo, uma vez localizada dorsalmente glia radial diferem daqueles revestimento.......

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Discussão

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Aqui nós detalhe a técnica de electroporação SVZ neonatal, uma técnica para rapidamente e de forma robusta e rotular manipular as células-tronco SVZ e seus descendentes. Há várias vantagens que tem a electroporação, em comparação com outras técnicas. Em primeiro lugar, dada a marcação focal de células, é capaz de discernir celulares autónomos e não autónomos efeitos célula. Manipulação, segundo genética utilizando sistemas indutíveis permite comparar o efeito antes ou após integração sináptica. Além disso, pode-se evita.......

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Divulgações

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Os autores não têm a revelação a fazer.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado por doações do Departamento de Defesa (prêmio de desenvolvimento Idéia, W81XWH-10-1-0041, AB), CT de células-tronco de subvenção (AB), e um Instituto Nacional de Saúde NRSA 10668225 (DMF). O presente material é baseado no trabalho, em parte suportado pelo Estado de Connecticut sob o Stem Cell Research Connecticut Programa de Subsídios. Seu conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Estado de Connecticut, o Departamento de Saúde Pública do Estado de Connecticut ou Inovações CT, Inc. A financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, a coleta de dados e análise, a ....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Nome do reagente Companhia Número de catálogo Comentários (opcional)
Tubulação Polido pesado borosilicato Instrumento Sutter BF150-110-10
Dual-Stage Vidro Micropipeta Puller Narishige PC-10H
Fast Green Fischer Scientific 0521192205
ECM 830 Praça da onda de pulso gerador Harvard Apparatus 45-0052
Tweezertrodes Harvard Apparatus 45-0488
Fibra Óptica Fonte de Luz Fisher Scientific 12-562-36
Halogênio de tungstêniolâmpada USHIO America, Inc 1002247
Picospritzer II Parker Instruments 052-0312-900

Referências

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  1. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  2. Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....

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Neonatal SVZ ElectroporationNeural Stem CellsElectroporation TechniqueDNA InjectionImmunohistochemistryMicroscopy AnalysisElectrophysiology MethodsCell Fate AnalysisPup Anesthesia

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