Cromossomo Preparação a partir de células cultivadas

Resumo

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células vivas, tais como linfócitos ou fibroblastos de pele, e a partir de organismos, incluindo seres humanos ou ratinhos. Estas preparações cromossômicas pode ser ainda utilizado para a rotina de bandamento G e procedimentos de citogenética molecular, como a hibridização fluorescente in situ (FISH), hibridização genômica comparativa (CGH), e cariotipagem espectral (SKY).

Resumo

Análise cromossómica (citogenética) é amplamente utilizado para a detecção de instabilidade cromossoma. Quando seguido por G-faixas e técnicas moleculares como a hibridização fluorescente in situ (FISH), este ensaio tem a poderosa capacidade de analisar células individuais para as aberrações que envolvem ganhos ou perdas de partes do genoma e rearranjos envolvendo um ou mais cromossomos. Nos seres humanos, anormalidades cromossômicas ocorrem em cerca de 1 a cada 160 nascidos vivos ^1,2, 60-80% de todos os abortos espontâneos ^3,4, 10% dos natimortos ^2,5, 13% dos indivíduos com doença cardíaca congênita ^6, 3-6% dos casos de infertilidade ^2, e em muitos pacientes com atraso no desenvolvimento e defeitos de nascimento ^7. A análise citogenética de malignidade é rotineiramente utilizado por pesquisadores e clínicos, como observações de anormalidades cromossômicas clonais foram mostrados para ter tanto significado diagnóstico e prognóstico ^8,9.60; isolamento cromossomo é de valor inestimável para a terapia gênica e células-tronco de organismos, incluindo primatas não-humanos e roedores ^10-13.

Os cromossomas podem ser isolados a partir de células de tecidos vivos, incluindo os linfócitos, fibroblastos da pele, amniócitos, placenta, da medula óssea e espécimes de tumor. Os cromossomas são analisados ​​na fase metafase da mitose, quando elas são mais condensada e, por conseguinte, mais claramente visíveis. O primeiro passo da técnica de isolamento cromossoma envolve o rompimento das fibras do fuso por incubação com Colcemida, para evitar que as células de prosseguir para a fase subsequente anafase. As células são, então, tratada com uma solução hipotónica e conservados no seu estado inchado com fixador de Carnoy. As células são, então, deixada cair sobre as lâminas e pode então ser utilizado para uma variedade de procedimentos. G-bandas envolve o tratamento de tripsina seguida de coloração com Giemsa para criar luz característica e faixas escuras. O mesmo procedure para isolar os cromossomas podem ser utilizados para a preparação de células para os procedimentos, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (CÉU) ^14,15.

Introdução

Análise cromossômica é uma técnica convencional utilizada em todo o mundo para diagnosticar instabilidade cromossômica e rearranjos que levam a desordens genéticas e malignidade ^1,2,8,9. Além disso, uma maior resolução para o diagnóstico e pesquisa de anormalidades genéticas e adquiridas constitucionais-cancro pode ser conseguido com a combinação dos procedimentos citogenéticas clássicas e metodologias citogenética molecular, tais como hibridação in situ fluorescente (FISH), a hibridação genómica comparativa (CGH) e cariotipagem espectral (SKY) ^14,15. Mais recentemente, estas técnicas têm sido utilizadas para a avaliação de instabilidad....

Protocolo

1. Cromossomo colheita de células aderentes

1. Protocolo padrão
   1. Cultivar células de acordo com as condições específicas de cultivo celular. Quando as células atingiram fase logarítmica (80% de confluência), adicionar 10 ul / ml de Colcemid com o frasco de cultura de célula. Recomenda-se um período mínimo de 2 x 10 ⁶ células.
   2. Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera de 5% de _CO2 durante 45 min. Usando uma pipeta estéril, transferir mídia a partir de células em um tubo de 15 ml. Ponha de lado.
   3. Lavar suavemente as células por adição de 2 ml de tampão de HBSS para o balão. Tampão do redemoinho ....

Resultados

Metáfase alta qualidade são essenciais para a análise cromossômica. Um ensaio bem sucedido produz cromossomos, que são bem espalhados e da morfologia cromossômica adequado. Cromossomos corretamente G-unido conter a luz característica e padrões de bandas escuras.

Figura 1. Uma propagação cromossômica .......

Discussão

Utilizámos o presente procedimento para o isolamento do cromossoma a partir de células de vários organismos, incluindo diferentes tipos de células obtidas a partir de humanos, macacos Rhesus, ratinhos e ratos, ^11,20-22. O protocolo padrão é fornecida, mas certas etapas principais variáveis ​​e podem ter de ser ajustados para estes diversos tipos de células. Vários passos específicos são cruciais tanto na preparação cromossômica e G-faixas para garantir a melhor qualidade possível dos resultados. Uma das variá.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
KaryoMAX Colcemid	Gibco	15212-012
HBSS Buffer	Gibco	24020-117
0,5% Tripsina EDTA 10x	Gibco	15400-054
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Buffer Tablets "GURR"	Gibco	10580-013
Geimsa Stain	Ricca Chemical Company	3250-16
Centrífuga 5810	Eppendorf
Metanol	Caledon Produtos Químicos de Laboratório	6700130
Ácido Acético Glacial	Krackeler Scientific Inc.	11-9508-05