Um modelo Zebrafish de Diabetes Mellitus e Memória Metabólica

Resumo

Memória metabólica é o fenômeno pelo qual complicações diabéticas persistir e progredir sem obstáculos, mesmo depois de euglicemia é alcançado farmacêutico. Descrevemos aqui um modelo de diabetes mellitus do peixe-zebra que é único na medida em que permite que o exame dos componentes mitoticamente transmissíveis epigenéticos de memória metabólica In vivo.

Resumo

Diabetes mellitus afeta atualmente 346 milhões pessoas e isso deverá aumentar para 400 milhões até 2030. Evidências de laboratório que larga escala ensaios clínicos revelou que o progresso complicações diabéticas desimpedida através do fenômeno da memória metabólica, mesmo quando o controle glicêmico é farmaceuticamente alcançado. A expressão do gene pode ser alterada através de alterações de forma estável epigenéticas que não só permitem que as células e organismos de responder rapidamente a mudanças de estímulos ambientais, mas também conferem a capacidade da célula para "memorizar" estes encontra quando o estímulo é removido. Como tal, os papéis de que estes mecanismos desempenham no fenómeno de memória metabólica estão actualmente a ser examinada.

Temos recentemente relataram o desenvolvimento de um modelo de peixe-zebra de tipo I diabetes mellitus e caracterizado este modelo para mostrar que zebrafish diabético não apenas exibem as complicações secundárias conhecidas, incluindo as alterações associadascom retinopatia diabética, nefropatia diabética e a cicatrização de feridas prejudicada, mas também exibem regeneração da barbatana caudal prejudicada. Este modelo é único na medida em que o peixe-zebra é capaz de regenerar o seu pâncreas danificado e restaurar um estado euglicémico semelhante ao que seria de esperar na pós-transplante de pacientes humanos. Além disso, múltiplos ciclos de amputação barbatana caudal permite a separação e estudo dos efeitos epigenéticos puros em um sistema in vivo sem potenciais factores de complicação do estado diabético anterior. Embora euglicemia é alcançada após a regeneração pancreática, a complicação diabética secundário de regeneração e cicatrização de feridas fin pele persistir indefinidamente. No caso de regeneração da barbatana prejudicada, esta patologia é mantida mesmo após vários ciclos de regeneração da barbatana nos tecidos aleta filha. Estas observações apontam para um processo subjacente epigenética existentes na memória de estado metabólico. Aqui apresentamos os métodos necessários para o sucesso gengerar a grupos de diabéticos e de memória metabólica de peixes e discutir as vantagens deste modelo.

Introdução

O diabetes mellitus (DM) é um problema de saúde sério e crescente que resulta em expectativa de vida reduzida devido a doença específica microvascular (retinopatia, nefropatia, neuropatia, cicatrização deficiente) e macrovasculares (doença cardíaca e acidente vascular cerebral) complicações ^1. Uma vez iniciado, complicações diabéticas continuar a progredir ininterrupto mesmo quando o controle glicêmico ^2,3 e este fenômeno foi denominado de memória metabólica ou o efeito legado. A presença deste fenômeno foi reconhecido clinicamente durante o início de 1990 como o "A Diabetes Controle e Julgamento Complicações (DCCT)" progrediu e desde então tem sido apoiada por vários estudos clínicos adicionais ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Modelos animais de DM têm sido fundamentais para descobertas relacionadas com a fisiopatologia das complicações da diabetes e da memória metabólica. De facto, a persistência de complicações diabéticas foi documentada em um modelo canino de diabetesretinopatia que desde então foi suportada por várias linhas de evidência experimental utilizando uma variedade de sistemas de cultura in vitro e em modelos animais ^{15,16,17,18,19,20,21.} Estes estudos mostram claramente que o resultado é uma hiperglicêmicos período inicial em anormalidades permanentes (incluindo a expressão génica aberrante) de órgãos / células-alvo e mecanisticamente sugere o envolvimento do epigenoma.

Epigenomas engloba todas as modificações da cromatina para um determinado tipo celular e são responsáveis ​​pelo perfil único de uma célula de expressão de genes. As modificações cromossómicas são dinâmicos durante o desenvolvimento de diferenciação celular, o apoio, são sensíveis a estímulos externos, são mitoticamente estavelmente herdada ^22,23 e podem ser alterados na doença ^24,25,26. Estes mecanismos epigenéticos incluem: postar translacionais modificações de histonas, não-canônico de inclusão variante das histonas em octomers, mudanças de acesso cromatina por metilação do DNA e de genescontrole de expressão através de RNAs não-codificadores micro ^27,28,29,30. Ao todo, processos epigenéticos permitir que as células / organismos para responder rapidamente às mudanças estímulos ambientais ^31,32,33, eles também conferem a capacidade da célula para "decorar" esses encontros uma vez que o estímulo é removido ^23,22. Assim, tal como os perfis de expressão de genes alterados resultantes de processos epigenéticos são estáveis ​​na ausência do sinal (s) que iniciou a eles e são hereditárias através da divisão celular, eles adquiriram grande interesse como subjacente mecanismos moleculares de patologias humanas, incluindo a memória metabólica. Os resultados que surgem no contexto de DM e epigenética avanços paralelos em outras doenças em que uma multiplicidade de mudanças epigenéticas induzidas pela hiperglicemia causam mudanças notáveis ​​persistentes em redes de transcrição de células (revisto em ^{34,35,36,37,38).}

O peixe-zebra tem sido um organismo modelo premier para estudantesdy desenvolvimento de vertebrados no entanto nos últimos 15 anos tem visto um crescimento exponencial na utilização deste organismo para o estudo de doenças humanas. ^39. Zebrafish modelos de doenças humanas foram estabelecidas abrangendo uma vasta gama de patologias humanas, incluindo as doenças genéticas e doenças adquiridas ^40,41,42. As muitas vantagens do peixe-zebra sobre organismos modelo incluem outros vertebrados alta fecundidade, tempo de geração curto, transparência através da idade adulta, os custos da habitação reduzidas e um conjunto de ferramentas para manipulação genética. Além disso, devido à conservação extensa de vias genéticas e da fisiologia celular entre os vertebrados e a capacidade para realizar rastreios de elevada capacidade de droga, o peixe-zebra foi usada com sucesso para a descoberta farmacêutica.

Nós desenvolvemos um modelo zebrafish adulto de diabetes mellitus do tipo I, utilizando o fármaco diabetogénico, estreptozocina. Temos caracteriza este modelo para mostrar que zebrafish diabético nãot exibir apenas os humanos conhecidos complicações secundárias mas, além disso, apresentam a regeneração de membros prejudicada (regeneração da nadadeira caudal) como consequência do ambiente hiperglicêmico. Além disso, relataram que zebrafish hiperglicêmico voltar a glicemia normal dentro de 2 semanas da retirada do fármaco, devido à regeneração de células pancreáticas beta endógenos, resultando em um estado glicêmico fisiologicamente normal. No entanto, em contraste, a regeneração de membros destes peixes permanece prejudicada na mesma extensão como no estado diabético aguda, indicando esta complicação persiste e é susceptível à memória metabólica. O principal ímpeto para gerar este modelo foi o de fornecer um sistema para estudar os componentes mitóticos estáveis ​​epigenéticas que suportam o fenómeno de memória metabólica na ausência de ruído de fundo do ambiente hiperglicêmico anterior. Na conclusão do protocolo fornecido aqui os tecidos e peixe-zebra ou selectivos podem ser processadas por qualquer ensaio adequado para a Researchers precisa. Temos utilizado com sucesso este procedimento para identificar as alterações do genoma persistentes na metilação do DNA induzidos pela hiperglicemia que são mantidos no estado de memória metabólica ^21.

Nós sentimos que este modelo de zebrafish de diabetes mellitus tipo I tem várias vantagens em relação aos sistemas inovadores outro modelo para o exame de memória metabólica. 1) Todos os nossos estudos podem ser realizados in vivo e como o peixe hiperglicémica anterior voltar a euglicemia pela regeneração da produção endógena de insulina, que não requerem injecções de insulina exógena. Portanto, o que evita os picos e vales de complicação no controlo da glicemia que podem ocorrer em animais que requerem insulina exógena. 2) Como descrito acima, a estimulação de fundo a partir do estado diabético anterior (isto é, a presença continuada de glicação avançada produtos finais e os marcadores de espécies reactivas de oxigénio) são eliminadas e, por conseguinte, pode-se examinar o puramente epigfactores enetic de memória metabólica. 3) Os ensaios podem ser realizados rapidamente, uma vez que demora aproximadamente 80 dias a partir da indução da diabetes até serem analisadas memória metabólica. 4) Caudal regeneração da barbatana é experimentalmente muito acessível e permite a manipulação genética e experimental fácil para o qual há uma grande variedade de ferramentas. 5) Caudal fin regeneração proporciona um método muito simples e quantificáveis ​​para avaliar memória metabólica e portanto vai permitir a descoberta de medicamentos futuro.

Protocolo

Todos os procedimentos são realizados seguindo as orientações descritas em "Princípios de Laboratório Animal Care" (Institutos Nacionais de Saúde não publicação. 85-23, revisado 1985) e aprovado Rosalind Franklin University Animal Care Institucional e uso de animais protocolo do Comitê 08-19.

Existem duas abreviaturas importantes que são utilizadas neste manuscrito. 1) DM: refere-se a peixe, que estão em estado de hiperglicemia aguda (300 mg / dl), e têm, pelo menos, 3 semanas. 2) MM: refere-se a peixes que foram 21 dias (ver protocolo) peixe DM e permitiu a restaurar o controle glicêmico através da regeneração pancreática. Isto é conseguido no interior (14) dias após a remoção da droga. Os peixes são considerados peixes MM partir deste ponto em diante. Também é importante notar que os peixes, que são referidos como controlo são tratados de forma idêntica como o peixe ou DM MM em termos do número de injecções (apenas solução salina), o tempo de incubação às temperaturas diferentes e o número e temporizaçãode amputações nadadeira caudal.

1. Geração de Zebrafish com Diabetes mellitus, peixe DM

1. Prepare tanto a recuperação e tanques de água anestésicos. Água de recuperação é de peixes de água normal. Para a água do anestésico suficiente adicionar 2-fenoxietanol, de modo que uma diluição de 1:1.000 em peixes de água normal, é alcançado.
2. Prepara-se uma solução de 0,3% (numa hotte) de estreptozocina (STZ) pela adição de 6 mg de STZ de 2 ml de cloreto de sódio a 0,09% e colocar imediatamente a solução em gelo. Isto irá fornecer a solução de injecção suficiente para a injecção de cerca de 20 peixes em cada 20 min. Se você ultrapassar a marca de 20 minutos, parar e fazer uma solução STZ fresco antes de prosseguir. Em um tubo de solução salina alíquota separada suficiente para os peixes de controle. Uma vez que a STZ é solubilizado todas as etapas subseqüentes não requerem uso coifa.
3. Encher uma seringa cc ½ equipado com uma agulha de calibre 27 1/2, com as soluções de controlo ou de STZ, assegurando que não existem bolhas de ar presas.
4. Anestesiatize cada peixe individualmente, colocando o peixe na água anestésico, e espere até que seu movimento cessa natação (1-2 min).
5. Uma vez anestesiados rapidamente coloque o peixe sobre um papel toalha para absorver o excesso de água, coloque o peixe no barco pesar e medir a massa do peixe.
6. Coloque o peixe em uma superfície firme (Petri tampa prato) para injecção.
7. Injectar a STZ ou a solução de controlo para a cavidade peritoneal do peixe, por inserção da agulha além do chanfro no aspecto posterior do peritoneu ventral.
8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) de STZ deve ser entregue para cada peixe e o volume da solução de 0,3% necessário pode ser calculado da seguinte forma.
   1. Multiplicar a massa de peixe (g) de 0,35 para se obter a quantidade de STZ em mg necessário.
   2. dividir o produto gerado acima por 3 para se obter o volume da solução de 0,3% necessários para a injecção de ul.
      Exemplo: Para um peixe 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 ul.
      O mesmo volume sem a STZ seria injectado por um peixe de controlo. Uma folha para volumes de injetar por massa de peixe deve ser gerado e usado para referência rápida.
9. Injeção seguinte coloque o peixe no tanque de água de recuperação e monitorá-los para a atividade de natação normal. Uma vez que este tenha sido alcançado, o peixe é transferido para um tanque de vida normal, que é mantida no intervalo de temperatura reduzida de 22 ° C - 24 ° C. Esta temperatura reduzida é crítico para a indução eficaz da hiperglicemia (diabetes mellitus, DM).
10. Embora a hiperglicemia é detectado dentro de 24 horas da primeira injecção, de forma a induzir um estado de hiperglicemia prolongada muito elevado o zebrafish requerem uma fase de indução de injecção frequente, seguida de injecções semanais de manutenção, como mostrado abaixo.

Semana 1: 3 injecções (Dia 1, 3, 5), Semana 2: 1 injeção (dia 12), a Semana 3: 1 injecção (dia 19),
Semana 4: (Dia 21) Executeensaio de interesse.

Neste ponto, o peixe-zebra são considerados como tendo sido em um estado prolongado de hiperglicemia e exibem as complicações diabéticas de retinopatia, nefropatia e regeneração da barbatana também prejudicada. Estes são referidos como peixes DM. Além disso, se desejado, o peixe pode ser mantido no estado hiperglicémico com injecções semanais de manutenção. Aproximadamente 5% de falecimento durante este processo deve ser esperado.

2. Coleta de sangue e glicemia de jejum (FBGL) Determinação

1. Cada grupo de peixes de MS e de controlo deve incluir peixe suficiente para determinar com precisão a FBGL média do grupo como este ensaio requer estes peixes para ser sacrificado.
2. Preparar um tubo rotulado PCR para cada amostra de sangue contendo 5 ul de solução salina normal estéril.
3. Para a coleta de sangue, anestesiar peixes como acima, retire toda a água, coloque o peixe sobre uma lâmina de microscópio e utilizando um bisturi, remove a cabeça do peixena base do opérculo.
4. Recolher o sangue (até 2 ul), que é libertado a partir do peixe na lâmina e adicionar rapidamente ao 5 ul de solução salina normal estéril pipetando para cima e para baixo para se certificar de que o sangue não entupir. Imediatamente colocar a amostra em gelo.
5. Determinar o volume da amostra de sangue medindo-se o volume total do líquido (soro fisiológico + do sangue) e então subtraindo a 5 ul de solução salina.
6. Transferir 5 ul do sangue diluído a partir de cada tubo de PCR para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e determinar a concentração de glicose no sangue, utilizando o Kit de Ensaio de Glucose QuantiChrome. Isto é realizado seguindo o protocolo do fabricante, sem excepção. Resultados esperados: peixes controle normal / 60 mg / dl e peixe DM 310 mg / dl.

3. Caudal Fin Regeneração Estudos

1. Anestesiar peixe, tal como descrito em 1,0-1,4.
2. Coloque o peixe em uma tampa de placa de Petri e amputar a nadadeira caudal em uma linha reta usando um tamanho de estéril10 bisturi proximal ao primeiro ponto de ramificação lepidotriquia enquanto visualiza o fin através de um microscópio de dissecação.
3. Permitir que o peixe se recuperar como em 1.10 mas coloque o peixe a 33 ° C para a fase de crescimento regenerativo do ensaio. Trata-se de uma temperatura estabelecida para a análise acelerada fin regeneração.
4. As barbatanas podem ser visualizados em qualquer amputação pós vez, porém rotineiramente examinar o crescimento regenerativo em 24, 28 e 72 horas seguindo-seção trans.
5. Anestesiar peixes como antes (ver 1,0-1,4), coloque o peixe sob um microscópio de dissecação equipado com uma câmera (nós usamos uma Nikon SMZ-1500 equipado com uma câmera de Q-imagem) e recolher todas as imagens fin de ampliação 1X com NIS software de elementos . A aleta deve ser espalhado para imagiologia de modo a que ela fique totalmente estendida, sem estiramento ou danificar o tecido e deve estar livre de quaisquer gotas de água. Para consistência coloque sempre o lado dorsal para a direita.
6. Imprimir imagens e medir o gro regenerativaárea wth usando o software Image J e o uso de uma almofada de desenho. Trace em torno de toda a área de um novo crescimento e determinar a área. Cada medição deve ser feita cinco vezes e em média para garantir a precisão do traçado. É importante que as imagens utilizadas não têm sombras ou gotículas de água uma vez que estes contribuem para erros na medição da área de crescimento.
7. Medir o comprimento do local da amputação ao longo do eixo dorsal-ventral e dividir a superfície determinada em 3,6 por esta medida. Isto permite que os peixes de tamanhos diferentes para ser comparado directamente.

4. Geração de Memória Metabólica (MM) Zebrafish

1. Iniciar um grupo de peixes de MS e seus controles adequados, conforme descrito na seção 1.
2. Aos 21 dias a determinar FBGL para um subconjunto de grupo e dividir o peixe DM em 2 subgrupos. Continuar semanalmente injecções de STZ por um dos grupos DM como controlos para a duração da experiência. Cessar STZ injecção para o segundo grupo e incubate peixe a uma temperatura normal. Dentro de 14 dias estes zebrafish irá restaurar insulina e glicose sanguínea normal de controle através de regeneração do pâncreas. Estes peixes são agora chamados MM (peixe memória metabólica).
3. No dia 30 de remoção de drogas após amputar as barbatanas caudais de controle, MS e MM peixe através do método descrito em 3.2.
4. Retornar peixe às condições de água normal para a regeneração da nadadeira por 30 dias. Isto permite que o crescimento do que nós denominamos, tecido memória metabólica.
5. No dia 60 executar uma segunda cirurgia (tal como descrito em 3.2) no interior do tecido que foi regenerado no período de 30-60 dias, e realizar o ensaio de regeneração caudal fin (3,1-3,7) Figura 1.
6. Isolar o tecido e fazer ensaio de interesse. Ver Tabela 1 para um resumo protocolo.

Resultados

Tipo I zebrafish diabético não apenas exibem as complicações secundárias conhecidas de retinopatia e nefropatia, mas também, exibem uma complicação adicional: regeneração da barbatana caudal prejudicada. Esta complicação tardia persiste devido à memória metabólica em peixes que restaurou o controle da glicose normal após um período hiperglicêmicos. Na Figura 2A (controle) e Figura 2B (memória metabólica) Imagens representativas de aletas em regeneração que foram capturadas a 72 hr pós-a...

Discussão

A diabetes mellitus é uma doença metabólica de desregulação, inicialmente diagnosticada como hiperglicemia, que, finalmente, resulta em danos nos vasos sanguíneos conduz a muitas complicações que persistem mesmo depois de todos euglicemia é alcançado embora intervenção farmacêutica. Esta persistência de complicações é referido como memória metabólica e vários estudos recentes têm examinado o papel que desempenham nos mecanismos epigenéticos este fenómeno. Aqui temos um protocolo detalhado que permite a geração de ambos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
Estreptozocina	Sigma Aldrich	S0130
2-fenoxietanol	Sigma Aldrich	P1126
Bisturi (tamanho 10)	Fisher Scientific	089275A
Os pratos de petri	Fisher Scientific	08-757-13
½ seringa cc, com 27 1/2 agulha de calibre	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glicose kit de ensaio.	Sistemas de bioensaio	DIGL-100
Cloreto de Sódio	Sigma Aldrich	S3014
Dissecando microscópio	Nikon	TMZ-1500	Qualquer microscópio de dissecação está bem.
Camera for Imaging	Nikon	Q imagem	Qualquer câmara é adequado.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Imagem
Elementos NIS	Nikon		Qualquer software de imagem é adequado.