Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitórios e correntes de membrana

Niels Voigt; Xiao-Bo Zhou; Dobromir Dobrev

doi:10.3791/50235

Artigo de método

Isolamento de miócitos atriais humanos para Medições Simultâneas de Ca

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DOI:

10.3791/50235

⸱

3 de julho de 2013

Niels Voigt^*¹^,² , Xiao-Bo Zhou^*² , Dobromir Dobrev¹^,²

¹Institute of Pharmacology, University of Duisburg-Essen , ²Division of Experimental Cardiology, University of Heidelberg

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Descrevemos o isolamento de miócitos atriais humanos, que podem ser utilizados para a intracelular de Ca^{2 +} Medidas, em combinação com estudos de patch-clamp eletrofisiológico.

Resumo

O estudo das propriedades eletrofisiológicas de canais iônicos cardíacos com a técnica de patch-clamp ea exploração de celular cardíaca Ca ^{2 +} anormalidades manuseio requer cardiomiócitos isolados. Além disso, a possibilidade de investigar miócitos de pacientes que utilizam estas técnicas é um requisito de valor inestimável para elucidar a base molecular das doenças cardíacas, tais como fibrilação atrial (FA). ^Uma Descrevemos aqui um método para o isolamento de miócitos atriais humanos, que são apropriados tanto estudos de patch-clamp e medições simultâneas de Ca ^{2 +} concentrações intracelulares. Primeiro, apêndices atriais direita obtidas de pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto são cortadas em pedaços pequenos de tecido ("método pedaço") e lavados em solução de Ca ^{2 +-free.} Em seguida, os pedaços de tecido são digeridos em colagenase e protease contendo soluções com 20 mM de Ca ^{2 +.} Posteriormente, os miócitos isolados são harvested por filtração e centrifugação da suspensão de tecido. Finalmente, a concentração de ^{Ca2 +} na solução de armazenamento de células é ajustada gradualmente para 0,2 mM. Brevemente discutidos o significado de Ca ^{2 +} e Ca ^{2 +} tamponamento durante o processo de isolamento e também proporcionar gravações representativos de potenciais de acção e as correntes de membrana, juntamente com a simultânea tanto de Ca ^{2 +} medições transientes, realizada nesses miócitos isolados.

Introdução

Estudar propriedades eletrofisiológicas de canais iônicos cardíacos com a técnica de patch-clamp ea exploração de celular Ca ^{2 +} anormalidades manuseio requer cardiomiócitos isolados. Estes são geralmente obtidos após a exposição in vitro de amostras de tecidos cardíacos de enzimas digestivas (colagenase, hialuronidase, peptidase, etc.) Desde o primeiro relato de isolamento de miócitos cardíacos viáveis em 1955 ² uma grande quantidade de protocolos foi desenvolvido a fim de colher cardiomiócitos atriais e ventriculares individuais a partir de diferentes espécies, incluindo ratinho, rato, coelho, cão, cobaia e humano. Nesta revisão, vamos nos concentrar no isolamento de miócitos atriais humanos. Em relação aos procedimentos para o isolamento de miócitos de outras espécies que se referem ao "Worthington Tissue dissociação guia" fornecido pelo Worthington Biochemical Corp, EUA ( www.tissuedissociation.com ).

protocolos de isolamento de miócitos atriais humanos são geralmente derivados a partir do método descrito por Bustamante, et ai. ³ Aqui nós fornecemos uma descrição passo a passo de uma técnica, que é adaptado de um método previamente publicado, a fim de obter miócitos atriais adequadas não só para os experimentos de patch-clamp, mas também para Ca ^{2 +} intracelular medições simultâneas ^4-11.

Protocolo

Protocolos experimentais precisa ser aprovado pelo comitê de ética local e todos os pacientes precisam dar consentimento informado por escrito. Nossa pesquisa foi aprovado pelo comitê de ética da Faculdade de Medicina de Mannheim, da Universidade de Heidelberg (# 2011-216N-MA) e foi realizado em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano. Todos os pacientes assinaram termo de consentimento.

0. A obtenção de tecido atrial humano

Durante os procedimentos de rotina de punção, em pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto de circulação extracorpórea, a ponta da aurícula direita é normalmente removida e pode ser usada para o isolamento dos cardiomiócitos atriais. Após a excisão da amostra de tecido é transferido imediatamente para um tubo Falcon de 50 ml estéril com ^{Ca2 +} livre transporte solução contendo 2,3-butanodiona monoxime (Tabela I; BDM, inibidor contráctil, impedindo miócitos contracture). Com o tempo de transporte entre 30 e 45 min, que não reconhecemos uma clara vantagem de arrefecimento ou oxigenação em relação ao número e qualidade dos cardiomiócitos atriais isoladas. Nos transportes em geral para o laboratório deve ser tão rápido quanto possível. No entanto, se for mais longo o tempo de transporte não pode ser evitada, o transporte, a 4 ° C em solução oxigenada pode ser vantajosa.

1. Prearrangements

Ligue o thermocirculator, que controla a temperatura do recipiente encamisado (Tabela II). Certifique-se de que a temperatura dentro do recipiente é igual a 37 ° C. Cobrir a proveta com uma tampa de vidro para manter uma temperatura constante no interior da taça ao longo de todo o processo de isolamento.
Pesa-se a colagenase I e protease XXIV em três copos de vidro e armazená-lo a temperatura ambiente. As enzimas serão diluídos imediatamente antes da utilização.
Loja 20 ml de uma solução de ^{Ca2 +} livre numa placa de Petri, a 4 ° C.
Loja 250 ml de ^{Ca2 +} livre em solução num banho de água a 37 ° C.

2. Limpeza do Tecido

Transfira a amostra de tecido em conjunto com a solução de transporte numa placa de Petri (~ 10 cm de diâmetro) e remover o tecido adiposo aproximadamente usando uma tesoura.
Pesa-se a amostra de tecido. Entre 200 e 600 mg são utilizados para isolamento de células. O tecido restante pode ser congelada em azoto líquido para posterior análise bioquímica.
Transfira a amostra de tecido para a placa de Petri contendo 20 ml de uma solução de ^{Ca2 +} livre, a 4 ° C (ver passo 1.3) e cortar a amostra de tecido em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm ³ de tamanho.
Os passos seguintes devem ser executadas a 37 ° C e sob gaseificação contínua com 100% _de O _2. Uma ponta de pipeta pode ser colocado no tubo de oxigénio para evitar a forte ebulição e gerar um fluxo de ar contínuo.
Transfira os pedaços de tecido juntamente com a solução de ² Ca ⁺ livre emao béquer com camisa e agitou-se cuidadosamente durante cerca de 3 min, com uma barra de agitação magnética.
Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para se acalmar por alguns segundos. Estirpe cuidadosamente o sobrenadante através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II). Retorne os pedaços de tecido contido da malha no copo usando uma pinça.
Encher o copo com Ca ^{2 +} solução gratuita e repita a etapa de lavagem 2.4 e 2.5, duas vezes.

3. Primeiro digestão enzimática

Re-suspender os pedaços de tecidos com 20 ml de solução de enzima E1 (Quadro I) contendo colagenase e protease e agita-se cuidadosamente durante 10 min.
Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl _2-solução para obter uma concentração final de 20 mM de Ca ^{2 +.}
Após 35 min coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) de uma maneira que a maioria dos pedaços de tecido permanecem no copo. Resto retornarchover pedaços de tecido a partir da malha para o copo.

4. Segundo digestão enzimática

Ressuspender os pedaços de tecido de novo com 20 ml de solução de enzima E2 colagenase I contendo apenas (Tabela I). Adicionar 40 ul de 10 mM de CaCl _2-solução imediatamente para se obter uma concentração final de 20 mM de Ca ^{2 +.}
Durante o segundo tesoura para cortar o uso de digestão mais coágulos tecido ocasionalmente.
Após 5 min tomar uma amostra, utilizando uma pipeta de Pasteur, para procurar a dissociação de células. Repita isso a cada 2-3 min até em forma de bastonete, cardiomiócitos estriados aparecer.
Pare de mexer e deixe os pedaços de tecido para estabelecer-se para cerca de 20-30 segundos.
Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 um, Tabela II) num tubo Falcon de 50 ml (um tubo). Retorne os pedaços de tecido contido da malha para o copo.
Re-suspender os pedaços de tecido no copo com 20 ml storasolução ge (Tabela I) e após ¹⁰ dissociar as células por trituração mecânica suave usando uma pipeta de 20 ml serológica com doseador. Tente evitar a formação de bolhas, desde bolhas são prejudiciais para a sobrevivência e qualidade celular.
Coe o sobrenadante cuidadosamente através de uma malha de nylon (200 mM, Tabela II) em um Falcon 50 ml (tubo B).

5. Preparação final e Ajuste de Final Ca ^{2 +} Concentração

Centrifugar os tubos Falcon ambos A e B (ver passo 4.5 e 4.7) a 95 xg durante 10 min.
Remove-se o sobrenadante de ambos os tubos cuidadosamente por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. Descartar o sobrenadante.
Re-suspender em ambos os peletes de 1,5 ml de solução de armazenamento (Tabela I), cada uma (temperatura ambiente).
Adicione duas vezes 7,5 mL de solução 10 mM CaCl ₂ para cada Falcon e mexa com cuidado. Incubar durante 10 minutos depois de cada passo.
Adicionar 15 ul de solução de _CaCl2 10 mM para se obter uma última concentração de ^{Ca2 +} de 0,2 mM.

6. O carregamento dos miócitos com o fluorescente de Ca ^{2 +} Fluo-indicador-3 AM (Figura 1)

Transferir 1,5 ml de suspensão de células (tubo A e / ou o tubo B) para um tubo de microcentrifugação de 2 ml (tubo Eppendorf).
Os seguintes passos devem ser executados tendo em consideração a sensibilidade à luz fluorescente do Ca ^{2 +} Indicador de Fluo-3.
Dissolve-se 50 mg do derivado do éster de acetoximetilo permeável membrana de Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabela III), em 44 mL do Pluronic F-127 (Tabela III), solução de reserva (20% w / v em DMSO anidro) para obter de 1 mm de Fluo-03:00 solução de stock, o que pode ser armazenada a -20 ° C durante, no máximo, de 1 semana.
Adicionam-se 15 ul do Fluo-03:00 solução estoque para o tubo de microcentrífuga contendo 1,5 ml de suspensão de células (ver passo 6.1) e agitecuidado.
Incubar a suspensão de células durante 10 minutos numa caixa opticamente opaca.
Resumidamente, centrifugar a cerca de 6.000 rpm.
Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1,5 ml de solução de banho (Tabela IV).
Deixe a suspensão celular por cerca de 30 min para de-esterificação, antes de iniciar os experimentos.

7. Simultâneas de patch-clamp e epifluorescência Ca ^{2 +} Medições

Desde que as medições de patch-clamp não são o principal tema desta revisão, referem-se ao leitor interessado em outras publicações fornecendo uma descrição mais aprofundada desta técnica. ^11-14 Por uma questão de exaustividade nós fornecemos um breve resumo de um protocolo para medir potenciais de ação ou L-tipo Ca ^{2 +} correntes, ambos com gravações simultâneas Ca ^{2 +-transitória.}

Durante as experiências de miócitos são superfused a 37 ° C com banho de solução quena (Tabela IV), utilizando um sistema de perfusão rápida (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Para as experiências de tensão-grampo, as correntes de K ⁺ são bloqueados pela adição de 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl ₂ (0,1 mmol / L) à solução de banho. Microeléctrodos de vidro de borosilicato e são utilizados devem ter resistências de ponta de 2-5 mohms quando cheio com a solução da pipeta (Tabela V). Além do Fluo-3 AM carregando dos miócitos (ver passo 6), Fluo-3 também está incluído na solução de pipeta (Tabela V). Fluorescência está animado a 488 nm e luz emitida (<520 nm) convertido em [Ca ^{2 +]} _i assumindo

figure-protocol-1

_d, em que k = constante de dissociação de Fluo-3 (864 nM), F = fluorescência de Fluo-3,. _Fmax = fluorescência de ^{Ca2 +-saturada} obtida no final de cada experiência ^{de 12} Ambos os sinais eléctricos e Ca ^{2 +} sinais epifluorescência são gravados simultaneamente. Os potenciais de ação são estimulados a 0,5 Hz no modo atual-clamp usando um ms pulsos de corrente de força limiar 1.2x. Tipo-L de Ca ^{2 +-correntes} são medidas no modo de voltagem-grampo com um potencial de manutenção de -80 mV e 100 mseg de rampa de pulso para -40 mV para inactivar o jejum de Na ^+-corrente, seguido por uma de 100 mseg ensaio de pulso para 10 mV a 0,5 Hz.

Resultados

Figura 2A mostra três exemplos representativos de miócitos atriais direitos humanos isolados. Para quantificar o rendimento das células que pipetar com 10 ul de suspensão de células (passo 5.5) numa lâmina de microscópio CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Colheitas de células em média, na Figura 2B indicam claramente que há uma tendência para os rendimentos mais baixos em células crónica AF (CAF) de amostras do doente (tubo A: 16,5 ± 3,1 células/10 ul (n = 29) versus 5,1 ± 2,3 células/10 ul (n = 10), em SR e CAF, respectivamente, p <0,05; tubo B: 17,9 ± 3,9 células/10 mL (n = 29) versus 5,9 ± 2,0 células/10 mL (n = 9) em SR e CAF, respectivamente, p = 0,107).

Os exemplos representativos de acção potenciais medições simultâneas e gravações de Ca ^{2 +} citosólico transientes são apresentados na Figura 3. Em cerca de 90% das células estudadas, tele acção potencial disparado Ca ^{2 +} liberação provoca contrações de células claras e regular. Como relatado anteriormente, o potencial de repouso da membrana, que é um indicador aceite para a integridade das células, em média, cerca de -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 / miócitos pacientes) e -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 / miócitos pacientes ) em SR e CAF, respectivamente (p> 0,05). ¹⁵ A Figura 4 mostra registos representativos de simultâneas por voltagem tipo-L de Ca ^{2 +} e de correntes de Ca ^{2 +} citosólico transientes. Aplicação da isoprenalina agonista β-adrenérgico não selectivos (1 uM), aumenta as amplitudes de ambos I _{Ca, L} e citosólica de Ca ^{2 +} transientes, sugerindo cascata de transdução de sinal β-adrenérgico intacta.

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Figura 1. Fluxograma dos miócitos Fluo-03:00 carregamento protocolo (veja o passo 6,1-6,5). m / v, massa / volume.

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Figura 2. A, miócitos atriais direito humano isolado depois de uma hora em solução de armazenamento. B, média ± SEM de rendimento celular contados em 10 ul de células em solução de armazenamento (ver passo 5.5). n significa o número de preparações em cada grupo. * P <0,05.

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Figura 3. Gravações representativas de ação e potencial acionado Ca ^{2 +} transientes (CAT), em um dos miócitos atrial do ritmo sinusal e um chronic paciente fibrilação atrial. Top: Injetado atual membrana (I _M), usado para a estimulação (0,5 Hz). Abaixo: gravação simultânea do potencial de membrana (V _M), e gato acionado (baixo). (Traçado de novo com a permissão de Voigt et al. 2.012) ¹⁵

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Figura 4. Gravações representativos da (1 uM) no efeito isoprenalina tipo L de Ca ^{2 +} desencadeada corrente ^{Ca2 +-transientes} (CAT), em um dos miócitos atrial de um ritmo sinusal e um doente de fibrilação atrial crónica. Top: Voltage-clamp protocolo (0,5 Hz). Abaixo: gravação simultânea de membrana líquida total de corrente (I _M), reflectindo predominantemente do tipo L Ca ^{2 +} atual (meio) e provocou Gato (baixo). (Traçado de novo com a permissão de Voigt,et ai. de 2012) ¹⁵

figure-results-5
Tabela I. Solutions.

figure-results-6
Tabela II. Equipamento específico.

figure-results-7
Tabela III. Substâncias para o carregamento de miócitos com Fluo-3 AM.

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Tabela IV. Solução do banho de patch-clamp.

figure-results-9
Tabela solução Pipeta V. de patch-clamp *.

Discussão

Aqui, nós descrevemos um método para o isolamento de miócitos atriais humanos de apêndices atriais direito obtidas de pacientes submetidos a cirurgia de coração aberto. De forma a utilizar estas miócitos para medições de Ca ^{2 +} citosólico que adaptado com um método previamente descrito ^4-11 omitindo EGTA a partir da solução de armazenamento.

Já em 1970, verificou-se que, embora os miócitos dissociar na presença de ^{Ca2 +} durante a digestão, todos eles foram em contractura e não viáveis. ^16,17 Assim, o isolamento de células é realizada em solução de ^{Ca2 +} livre. Contudo, a re-introdução de concentrações fisiológicas de Ca ^{2 +} resultou numa rápida influxo de ^{Ca2 +} e na morte celular. Isto foi descrito como o ^{2 +} Ca paradoxo fenómeno que foi inicialmente observada em corações perfundidos por Zimmerman e Hulsman. ¹⁸ modificações dos meios de isolamento, incluindo a redução do pH para 7,0, ^{19 ²⁰ adição de taurina ou de pequenas quantidades de Ca ^{2 +} (veja passo 3.2 e 4.1), ^21, bem como o armazenamento de miócitos isolados em EGTA, contendo solução de ^{armazenagem-22,} têm sido sugeridos para impedir o paradoxo de Ca ^{2 + 17.} No entanto, é bem conhecido que o Ca ^{2 +} tamponamento através EGTA reduz a amplitude de tipo-L de Ca ^{2 +} corrente induzida por Ca ^{2 +} amplitudes transientes e resulta numa deterioração bifásica dos transientes de Ca ^{2 + 23.} Portanto, é omitida EGTA ao longo de todo o processo de isolamento, a fim de obter os transientes de Ca ^{2 +} com propriedades típicas e decai monofásicas. Para proteger as células do Ca ^{2 +} paradoxo que aumentou a última concentração de ^{Ca2 +} da solução de armazenamento de uma forma gradual até 0,2 mM.}

A escolha da colagenase é provavelmente o passo mais crítico para o sucesso do isolamento dos miócitos. Coll convencionalagenases são preparações brutas obtidas a partir de Clostridium histolyticum e contêm colagenase, além de uma série de outras proteases, polissacaridases e lipases. Com base nas suas colagenases composição geral são subdivididas em tipos diferentes. Worthington ²⁴ Tipos colagenase I e II têm sido utilizados com sucesso no isolamento de miócitos atriais humanos ^{4-10,15,25-30.} Em nosso protocolo atualmente descrito recomendamos o uso de colagenase O tipo I, apesar de, também foram capazes de obter quantidades aceitáveis de células viáveis utilizando colagenase de Tipo II. No entanto, mesmo dentro de um único tipo de colagenase há uma variação significativa de lote para lote em relação às actividades enzimáticas. Estas variações exigir a selecção cuidadosa e lote de teste de vários lotes para optimizar procedimento de isolamento. A ferramenta disponível batch-seleção on-line a partir de Worthington Biochemical Corp ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) pode ser usada para encontrar os lotes disponíveis com uma composição que tem sido mostrado para ser adequado para o isolamento de miócitos atriais humanos. Atualmente nós usamos colagenase tipo I com 250 U / mg atividade da colagenase, 345 U / mg atividade caseinase, 2,16 U / mg atividade clostripaína e 0,48 U / mg atividade tríptica (lote # 49H11338).

As células obtidas utilizando o processo descrito neste manuscrito podem ser utilizadas dentro de 8 horas para os estudos de patch-clamp, Ca ^{2 +} medições transientes e uma combinação de ambos. ¹⁵ Além disso, estas células permitem a medição de contracção celular, em resposta à estimulação do campo eléctrico ou estimulação elétrica usando a pipeta de patch-clamp (observações não publicadas).

Divulgações

Worthington Biochemical Corp apoiaram esta publicação, cobrindo os custos de produção do arquivo de vídeo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Agradecimentos

Além disso, agradecemos aos cirurgiões cardíacos da Universidade de Heidelberg para a prestação de tecido atrial humano e Claudia Liebetrau, Katrin Kupser e Ramona Nagel por sua excelente suporte técnico. Um agradecimento especial também para Andy W. Trafford para suas sugestões e conselhos durante o estabelecimento dos Ca ^{2 +} medidas transitórias. Os autores desejam expressar sua profunda gratidão aos membros do Departamento de Farmacologia e Toxicologia (cabeça: Ursula Ravens), da Universidade de Tecnologia de Dresden pela oportunidade que nos ofereceram para aprender técnicas e habilidades básicas em eletrofisiologia celular e isolamento dos cardiomiócitos.

Pesquisa dos autores é apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Do769/1-1-3), o Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa, através da Rede de Competência Fibrilação Atrial (01Gi0204) e do Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular, a União Europeia através de o EuRede ropeia para Pesquisa Translacional em Fibrilação Atrial (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, o projeto de integração em larga escala, Proposta n º 261057) ea Aliança de Investigação Europeia-América do Norte fibrilação atrial (ENAFRA) concessão de Fondation Leducq (07CVD03).

A visão geral do esquema mostrado no arquivo de vídeo foi produzido usando Servier arte médica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
			Solução de transporte
Albumina	Sigma-Aldrich	A3059	Solução de armazenamento: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	Solução de transporte: 30
DL-b-Hidróxi-b-butírico	Sigma-Aldrich	H6501	Solução de armazenamento: 10
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Solução de transporte: 20 Solução livre de Ca2+: 20 Solução enzimática E1 e E2: 20 Solução de armazenamento: 10
Ácido L-glutâmico	Sigma-Aldrich	G1251	Solução de armazenamento: 70
KCl	Merck	1049360250	Solução de transporte: 10 Solução livre de Ca2+: 10 Solução enzimática E1 e E2: 10 Solução de armazenamento: 20
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Solução de transporte: 1,2 Solução livre de Ca2+: 1,2 Solução enzimática E1 e E2: 1,2 Solução de armazenamento: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Solução de transporte: 5 Solução livre de Ca2+: 5 Solução enzimática E1 e E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Solução de transporte: 5 Solução livre de Ca2+: 5 Solução enzimática E1 e E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Solução de transporte: 100 Solução livre de Ca2+: 100 Solução enzimática E1 e E2: 100
Taurina	Sigma-Aldrich	86330	Solução de transporte: 50 Solução livre de Ca2+: 50 Solução enzimática E1 e E2: 50 Solução de armazenamento: 10
Colagenase I	Worthington	4196	Solução enzimática E1 e E2: 286 U/mL
Protease XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Solução enzimática E1 e E2: 5 U/mL*
pH			Solução de transporte: 7,00 Solução livre de Ca2+: 7,00 Solução enzimática E1 e E2: 7,00 Solução de armazenamento: 7,40
ajustado com			Solução de transporte: NaOH 1 M Solução livre de Ca2+: NaOH 1 M Solução enzimática E1 e E2: NaOH 1 M Solução de armazenamento: KOH 1 M
Concentrações em mM, salvo indicação em contrário. BDM, monoxima de 2,3-butanodiona. *A Protease XXIV está incluída apenas na solução enzimática E1.
Tabela I. Soluções.


Malha de náilon (200 μm)	VWR-Alemanha	510-9527
Béquer de reação com jaqueta	VWR	KT317000-0050
Tabela II. Equipamentos específicos.


Dimetil-sulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (embalagem especial)	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Tabela III. Substâncias para carregamento de miócitos com Fluo-3 AM.


4-aminopiridina*	Sigma-Aldrich	A78403	Solução de banho: 5
BaCl2*	Sigma-Aldrich	342920	Solução de banho: 0,1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Solução de banho: 2
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Solução de banho: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Solução de banho: 10
KCl	Merck	1049360250	Solução de banho: 4
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Solução de banho: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Solução de banho: 140
Probenecida	Sigma-Aldrich	P8761	Solução de banho: 2
pH			Solução de banho: 7,35
ajustado com			Solução de banho: HCl 1 M
Tabela IV. Solução de banho para patch-clamp. *4-aminopiridina e BaCl foram incluídos apenas para experimentos de clamp de tensão.


Sal de potássio do DL-aspartato	Sigma-Aldrich	A2025	Solução da pipeta: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Solução da pipeta: 0,02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	Solução da pipeta: 0,1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Solução da pipeta: 10
KCl	Merck	1049360250	Solução da pipeta: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Solução da pipeta: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Solução da pipeta: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	Solução da pipeta: 0,1
pH			7,20
ajustado com			KOH 1 M
*Tabela V. Solução da pipeta para patch-clamp.** Nos dias experimentais, a solução da pipeta é mantida em gelo até o uso. *Fluo-3 é adicionado a partir de uma solução estoque de 1 mM nos dias experimentais.

Referências

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