Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Resumo

Um protocolo para a análise do ciclo celular viva Drosophila Tecidos utilizando o Attune Acústico Cytometer Foco é descrito. Este protocolo prevê, simultaneamente, informações sobre o tamanho da célula familiar, número de celular, conteúdo de DNA e tipo de célula via linhagem traçado ou expressão específica de tecido de proteínas fluorescentes In vivo.

Resumo

A citometria de fluxo foi utilizada para obter informação sobre o conteúdo de ADN numa população de células, para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular. Esta técnica tem sido aumentado com sucesso para os tecidos mitóticas do organismo-modelo de Drosophila melanogaster para estudos genéticos de regulação do ciclo celular in vivo. Quando combinada com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula e manipulações genéticas, pode-se obter informações detalhadas sobre os efeitos sobre o número de células, o tamanho da célula e do ciclo celular phasing in vivo. No entanto, este método de células vivas foi contado com a utilização da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante, limitando aos utilizadores citómetros de fluxo equipado com um laser de UV. Nós modificamos este protocolo para usar uma tintura nova célula viva DNA, Vybrant DyeCycle Violet, compatível com o violeta do laser 405nm mais comum. O protocolo aqui apresentado permite a análise do ciclo celular eficiente juntamente com célulastipo, o tamanho relativo da célula e informação do número de células, em uma variedade de tecidos de Drosophila. Este protocolo estende a técnica útil para a análise do ciclo celular de tecidos vivos de Drosophila para um pequeno analisador de bancada, a Focagem Citómetro Attune acústica, o que pode ser executado e mantidas numa escala de um único laboratório.

Introdução

A citometria de fluxo pode ser usado para as medições de viabilidade celular, o tamanho da célula relativo, teor de ADN e expressão de proteína fluorescente em populações de células vivas. Devido à replicação do ADN nuclear durante a fase S, as informações sobre o conteúdo de ADN numa população de células pode ser usada para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular ^1-3. Este método tornou-se um elemento fundamental da análise do ciclo celular, em sistemas modelo de leveduras aos mamíferos.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster, tornou-se um sistema modelo excelente para a anál....

Protocolo

1. Fly Pecuária

1. Cruz voa de genótipos desejados em frascos de plástico estreitas com 10 ml de levedura-Glucose Médio ³ ou outros meios de comunicação ricos em proteínas de sua escolha. As extensas Drosophila transgénicas ferramentas disponíveis para a expressão específica de tecido e da linhagem de rastreio com a expressão da proteína fluorescente in vivo estão descritos em detalhe noutro local ^4,5. Transfira os pais frascos frescos diariamente para obter série de 24 coleções de progênie RH ou para o estadiamento mais preciso, coletar embriões em placas de ágar e transferir larva recém eclodida para frascos,....

Resultados

A Figura 2 mostra resultados representativos para uma amostra de larvas de asa, expressando GFP na metade posterior do tecido, utilizando o modelo previsto a GFP. Resultados semelhantes são obtidos com o mesmo tipo de tecido e padrão de expressão para a RFP, utilizando o modelo de RFP fornecida (Figura 3A). Os modelos e voltagens fornecidas (Tabela 2) são adequados para análise de olhos larvais (Figura 3B), cérebros e asas, assim como os olhos, cérebros pupa (Fi.......

Discussão

O protocolo aqui descrito permite a análise do ciclo celular, o tamanho da célula relativo e número relativo de células em tecidos de Drosophila vivo em vários estágios de desenvolvimento. Quando esta análise é acoplado com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula ou linhagem rastreamento, informações detalhadas podem ser obtidas sobre respostas celulares ao ciclo celular discreta ou perturbações de crescimento. Como prova de princípio, interrompido quietude no cérebro da mosca pupa expres.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de ensaio de 5 ml de poliestireno de 12x75 mm	BD Falcon	352058	tubos de 5 ml Attune
Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	configuração azul / violeta
Software de citômetro Attune (versão 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC only
Contas de Rastreamento de Desempenho Attune (5 x 106 contas/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	Para teste de desempenho diário
Pinça Dumont #5 Inox	Ferramentas de Ciência Fina	11251-20
Placas de embriões 30 mm x 12mm	Microscopia Eletrônica Sciences	70543-30 Placas de	dissecação de vidro
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf 022670051
Solução de Tripsina-EDTA (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tü Tesoura de mola bingen	Fine Science Tools	15003-08	Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet	Stain Life Technologies / Invitrogen	V35003
Table 1. Reagentes e instrumentos necessários.
Solução de coloração de DNA vivo (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ livre de PBS (pH7.2) 9 ml 10X Tripsina-EDTA (Sigma) 5 μ l Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (observe que esta é 0,25 vezes a concentração recomendada para células de mamíferos. Descobrimos que concentrações mais altas são tóxicas para as células Drosophila.) 10X Ca2+ Mg2+ PBS livre (pH7,2): 1,37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibásico), 20mM KH2PO4 (monobásico) ajustado ao pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Limiar (x1000) 100 10 10 10 Tensão (mV) 2950 4250 1800 1150 Tabela 2. Definição de limiar e tensão para a análise na Figura 2.