Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Resumo

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Resumo

O uso de cardiomiócitos primários (CMS), em cultura tem proporcionado um complemento poderoso para modelos murinos de doenças do coração em avançar na compreensão de doenças do coração. Em particular, a possibilidade de estudar a homeostase de íons, função canal iônico, excitabilidade celular e acoplamento excitação-contração e suas alterações em condições de doentes e por mutações causadoras de doenças levaram a insights significativos sobre doenças cardíacas. Além disso, a falta de uma linha de células adequada imortalizado para imitar adulto CMs, e as limitações dos CMs neonatal (que não têm muitos da característica biomecânica estrutural e funcional do adulto CMs) na cultura têm dificultado a compreensão da complexa interação entre as vias de sinalização, canais iônicos e propriedades contráteis no coração adulto reforçando a importância do estudo adultos cardiomiócitos isolados. Aqui, apresentamos métodos para o isolamento, a cultura, a manipulação da expressão gênica por adenovírus-expreproteínas sseD, e posterior análise funcional dos cardiomiócitos do rato adulto. O uso destas técnicas irá ajudar a desenvolver uma visão mecanicista em vias de sinalização que regulam a excitabilidade celular, Ca ^{2 +} dinâmica e contratilidade e fornecer uma caracterização muito mais fisiologicamente relevante de doença cardiovascular.

Introdução

Modelos murinos de doenças cardiovasculares têm servido como ferramentas eficazes para elucidar os mecanismos fundamentais de doença ^1,2, bem como para identificar potenciais alvos terapêuticos ^1,3. Em particular, o uso de ambos os modelos de murino de doença cardíaca adquirida (tais como sobrecarga de volume) ^4,5 e modelos de ratinhos transgénicos têm avanços na compreensão da doença cardíaca ^6-8. A utilização de técnicas de cultura celular para estudar cascatas de sinalização ^3,9,10 e alterações em proteínas individuais que estão subjacentes a excitabilidade celular e o acoplamento de excitação-contracção no co....

Protocolo

1. Cardiomyocyte Isolamento

Materiais (Figura 1)

Microdissecting fórceps
Uma pinça
Pinça hemostática delicados
Pinça hemostática
Microdissecting, serrilhados, fórceps curvos
Tesoura operacionais, em linha reta
Tesoura Operacionais, curvo
Tubos de 15 ml Falcon (5)
60 milímetros placa de Petri
Tampão fosfato (PBS)
Nylon Mesh - tamanho 400 mM poros
Pequeno funil
Cera revestido, trançado de seda 4-0, 19 mm, 7-10 cm de comprimento
Agulha não-hipodérmica, fim brusco, 24 G ou animal-alimentação agulha comercial (....

Resultados

O isolamento dos adultos cardiomyoctyes resultados em células em forma de bastonete, estriados, e quiescentes (não bater espontaneamente) (Figura 5A). As células mortas vão olhar arredondado e sem estrias estarão presentes. As células quiescentes podem ser cultivadas e transfectadas com o adenovírus para manipular a expressão do gene (Figuras 5B e 5C). Após 24 horas de cultura, a morfologia das células vivas não muda, elas ainda são ^{Ca2 +-tolerante,} e que pod.......

Discussão

Neste relatório, nós descrevemos as técnicas necessárias para o isolamento do sucesso e da cultura do adulto CMs do coração mouse. A nossa técnica permite o estudo subsequente da função LV e excitabilidade utilizando os métodos descritos acima. O parâmetro fundamental para o estudo da funcionalidade do adulto CMs é a saúde ea qualidade do CMs isoladas. Como descrito acima, as nossas técnicas de permitir um elevado rendimento de células funcionais que são susceptíveis a manipulação da expressão de genes usando as infecçõ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de sódio	Sigma	S7653
Cloreto de potássio	Sigma	P9333
Cloreto de magnésio	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Fosfato de sódio monobásico	Sigma	S8282
D-glicose mínima	Sigma	G8270
Taurina	Sigma	T0625
2,3-Butanodiona Monóxido	Sigma	B0752
Colagenase B	Roche Ciência Aplicada	11088807001
Colagenase D	Roche Ciência Aplicada	11088858001
Protease XIV de Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumina de soro bovino	Sigma	A2153
Cloreto de cálcio	Sigma	C8106
Meio essencial mínimo	Sigma	51411C
Solução de albumina de soro bovino	Sigma	A8412
L-glutamina	Sigma	G3126
Penicilina-estreptomicina	Sigma	P4333
Meio de selenito de insulina-transferrina-sódio suplemento	Sigma	I1884
Cloreto de Césio	Sigma	289329
Glutamato	Sigma	G3291
Adenosina 5'-trifosfato magnésio sal	Sigma	A9187
Etilenoglicol-bis(2-amina– tiléter)-N,N,N',N'-ácido tetracético	Sigma	E3889
Solução de hidróxido de césio	Sigma	232041
Solução de hidróxido de tetraetilamônio	Sigma	86643
OptiVisor viseira binocular de vidro óptico	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Pinça de tecido, 5.5", 1x2 dentes	Roboz Scientific	RS-8164
Pinça Moloney - 4.5" (11.5 cm) de comprimento ligeira curva, serrilhada	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Pinça, Dumostar, tamanho da ponta 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Pinça Packer Mosquito 5" Reta Plana	Roboz Scientific	RS-7114
Tesoura de Micro Dissecação 4.5" Curvada Afiada/Afiada	Roboz Scientific	RS-5917
Tesoura de Micro Dissecação 3.5" Reta Afiada/Afiada20mm	Roboz Scientific	RS-5907