Avaliando fenótipos Neurodegenerativas em<em&gt; Drosophila</em&gt; Neurônios dopaminérgicos subindo Ensaios e toda Imunocoloração Cérebro

Resumo

Aqui nós descrevemos dois ensaios que foram estabelecidos para estudar neurodegeneração idade-dependente de dopaminérgicos (DA) neurônios Drosophila: A escalada / ensaio geotaxis negativa induzida sobressalto que permite estudar os efeitos funcionais de neurónios DA degeneração e a imunomarcação de tirosina-hidroxilase, que é usado para identificar e contar os neurónios do cérebro de DA em montagens inteiras.

Resumo

Drosophila melanogaster é um organismo modelo valioso para estudar processos degenerativos do envelhecimento e patológicas do sistema nervoso. As vantagens da mosca como um sistema experimental incluir sua rastreabilidade genética, vida curta ea possibilidade de observar e analisar quantitativamente os comportamentos complexos. A expressão de genes ligados à doença em populações neuronais específicas do cérebro de Drosophila, pode ser usado para modelar doenças neurodegenerativas humanas, tais como a doença de Parkinson e de Alzheimer ^5.

Dopaminérgicos (DA) neurônios estão entre as populações mais vulneráveis ​​neuronais no cérebro humano envelhecimento. Na doença de Parkinson (DP), a desordem de movimento neurodegenerativa mais comum, a perda acelerada de DA neurónios conduz a uma deterioração progressiva e irreversível da função locomotora. Além da idade e exposição a toxinas ambientais, a perda de neurónios DA é exacerbado por mutações pontuais no codificanteou regiões promotoras dos vários genes. A identificação de tais alelos DP associados fornece a base experimental para a utilização de Drosophila como um modelo para estudar a neurodegeneração de neurónios DA in vivo. Por exemplo, a expressão do gene α-sinucleína humana PD-ligados em Drosophila neurônios DA recapitula algumas características da doença humana, por exemplo, perda progressiva de neurônios DA e declínio da função locomotora ^2. Assim, este modelo tem sido utilizado com sucesso para identificar potenciais alvos terapêuticos na DP ^8.

Aqui nós descrevemos dois ensaios que têm sido comumente usados ​​para estudar a neurodegeneração idade-dependente de Da neurônios em Drosophila: um ensaio de escalada com base na resposta de sobressalto geotaxis negativa induzida e tirosina hidroxilase immunostaining de cérebro adulto todo monta para monitorar o número de neurônios DA em diferentes idades. Em ambos os casos, a expressão in vivo de t UASransgenes especificamente em neurónios DA pode ser conseguido através de uma tirosina-hidroxilase (TH)-Gal4 promotor de linha de condutor ^{3, 10.}

Introdução

A especificidade dos ensaios descritos aqui baseia-se no uso de uma linha de mosca Gal4 que explora as sequências reguladoras do gene da hidroxilase de tirosina, para conseguir a expressão específica de neurónios dopaminérgicos ^3. Tirosina hidroxilase catalisa a primeira e passo limitante da velocidade na síntese de dopamina. Imunorreactividade TH na mosca sobrepõe cérebro adulto com a da dopamina, tornando TH um bom candidato para identificar neurónios DA in vivo (ver, por exemplo ^6). Além disso, o padrão de expressão THGal4 é mais específico do que a de outras linhas, tais como Gal4 DdcGal4, que contém as sequências reguladoras a partir do gene da dopa descarboxilase e dirige a expressão transgénica não apenas em neurónios DA, mas também nos neurónios serotoninérgicos e subconjuntos de células gliais ³ .

Feany e Bender (2000) observaram pela primeira vez que a expressão de pan-neuronal do gene α-sinucleína humana DP-linked acelera a perda progressiva de stageotaxis comportamento negativo rtle induzida em Drosophila. Temos observado resultados similares usando a linha DA-neurônio específico THGal4 para conduzir o expressionof uma α-sinucleína transgene ¹⁰ e usou este funcional de leitura para estudar o papel neuroprotetor da via Nrf2 neste Drosophila modelo de PD ^14. O ensaio específico aqui descrito é adaptado a partir de ² e ^3.

O cérebro de Drosophila contém mais de 100 neurónios DA, dispostos em, pelo menos, cinco grupos diferentes (PPL1, PPL2, PAL PPM1 / 2, ppm3) que podem ser visualizados nos seus suportes de a totalidade do cérebro por meio de microscopia confocal (ver, por ^{exemplo, 11} e ^7). É ainda controverso se o número de neurónios DA em declínios cerebrais Drosophila com ⁹ anos ^{de idade, 11,} no entanto, dependente da idade, a neurodegeneração é observada nas moscas onde os genes PD-linked foram mutados / overexpressed para modelar doenças humanas5. A expressão de humano α-sinucleína em DA neurónios tem tal efeito e, consequentemente, tem sido utilizada como um modelo para a DP. Aqui nós descrevemos um ensaio para neurônios DA contar no cérebro todo montado usando TH como um marcador de células. Este ensaio foi adaptado a partir de ¹³ e ^10.

Protocolo

1. Sobressalto induzida Ensaio geotaxis Negativo

1. Selecione moscas do genótipo desejado, separá-los por gênero, aleatoriamente agrupá-los em grupos de 20-30 animais e lançá-los em novos frascos de comida a cada 2-3 dias, teste cada conjunto de moscas (ou seja, grupos pareados por idade, uma coorte / genótipo) pelo menos uma vez por semana.
2. Trinta minutos antes do teste geotaxis negativo, anestesiar as moscas com CO ₂ e colocá-los em tubos de plástico transparente pré-rotulados feitos com dois frascos vazios de alimentos (ver Tabela de Materiais) Cadastrado em suas aberturas com fita adesiva transparente (dimensões da câmara: 19 cm x 2,85 cm). Em nossos ensaios que normalmente usam 25 moscas / tubo.
   Nota. O tempo de recuperação da anestesia pode ser variada desde alguns minutos a várias horas (por exemplo, S / N) e devem ser optimizados para os genótipos específicos testados.
3. Marcar alturas diferentes (de 1 a 20 cm) sobre um pedaço de papel e fita de papel em uma as superfícies verticaise, perpendicular ao banco.
4. Coloque os tubos na frente do papel: os tubos devem estar todos alinhados e tão perto quanto possível do papel para permitir a medição da altura exata.
5. Coloque a câmera digital (consulte a tabela "Equipamento Especial") na frente dos tubos, a uma distância de 20-30 cm do papel, em um suporte (por exemplo, uma caixa de ponteira), selecione a opção "filme" e começar gravação, neste momento você também deve iniciar um timer para controlar o tempo entre ensaios consecutivos.
6. Permitir que as moscas se acumulem na parte inferior do tubo, tocando o tubo durante alguns segundos (por exemplo, 10 segundos). Este passo deve ser realizado de forma consistente (ou seja, igual duração, a mesma força, o mesmo operador) durante todo o experimento.
7. Movimentos Record 'voa com a câmera digital de 10 seg.
8. Repita os passos de 1,5-1,7 catorze vezes em intervalos de um minuto.
9. Analisar os dados:
   1. Contar o número de moscas que estão acima do2 centímetros marca após 10 segundos por inspeção visual dos filmes gravados.
      Nota: Em nossas condições de ensaio geotaxis comportamento negativo das moscas não durou além do primeiro 10 segundos depois surpreendente (ou seja, moscas começaram a se mover em todas as direções 10 segundos depois surpreendente deles). A distância mínima subiu por moscas de controle (ou seja, 1 semana atrás moscas expressando o motorista THGal4, veja a legenda da Figura 1) nesta janela de tempo foi de 2 cm. Assim, foi utilizada a marca de 2 cm como referência para a análise das atividades de escalada de moscas de diferentes idades e genótipos de 10 segundos após o início do comportamento. Estes parâmetros podem exigir ajuste para ter em conta as diferenças no comportamento das moscas testados (devido, por exemplo, a diferentes origens genéticas ou condições de laboratório). Observe que em nossas condições de ensaio, todos os genótipos testados desempenho pior ou semelhante para as moscas do genótipo controle.
   2. Tomar a média dos resultados dos quinzeprovações.
   3. Média expresso como uma percentagem do número total de moscas no tubo (= actividade escalada%), o número de repetições (N) é dado por o número de grupos independentes testadas para cada genótipo
   4. Avaliar a significância estatística entre os diferentes genótipos ao longo do tempo. Isto pode ser realizado com o teste t de Student (quando se compara dois genótipos) ou de uma análise ANOVA de 2 vias seguido pelo teste de Bonferroni post-hoc (ao realizar comparações múltiplas) utilizando programas comerciais, tais como o GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, EUA).

Nota

Realizamos todos os nossos ensaios na mesma hora do dia, à TA e sob as mesmas condições de iluminação. Mantendo as moscas em um ambiente de ciclo de 12 hr luz / escuro é aconselhável controlar o efeito dos ritmos circadianos no comportamento locomotor das moscas.

2. Tirosina hidroxilase ImunofluorescênciaEnsaio de Montes cérebro inteiro

Soluções e tampões

Solução fixadora: 4% de paraformaldeído (PFA) em tampão fosfato salino (PBS)

Tampão de lavagem: 0,1% de Triton X-100 em PBS

0,1 M de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 e 0,5% de BSA: Tampão de bloqueio

Meios de montagem: Mowiol-Dabco (ver protocolo descrito no Harlow E, Lane D., Antibodies-Um manual de laboratório Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA, 10:418 (1988))

Procedimento

1. Coloque moscas em um prato de dissecação enchido com 70% de EtOH durante cerca de 1 min para remover a cera cutícula.
2. Transferência voa para outro prato dissecção preenchido com PBS gelado.
3. Dissecar o cérebro:
   1. Coloque a voar com o lado ventral para cima (opcional: asas remover e pernas).
   2. Puxe a cabeça para fora do corpo: use um conjunto de pinças parasegurar o corpo e outro para segurar a cutícula sob o olho para evitar danos ao cérebro
   3. Retire a tromba.
   4. Segurar o cutícula cabeça em lados opostos da fenda deixada em aberto após a remoção da tromba e puxar em direcções opostas até que o cérebro é retirado da cápsula cabeça.
   5. Remova toda a cutícula do cérebro.
   6. Remover todo o tecido traqueal cheia de ar, o que irá impedir o cérebro de flutuar durante as seguintes etapas de incubação.
4. Cortar a poucos milímetros da ponta de uma ponta de pipeta P-200 e equilibrar com uma solução a 0,1% de Triton X-100/PBS
5. Com a ponta de pipeta P-200 preparados, transferir os cérebros para um tubo de 0,5 ml de Eppendorf encheu com 0,5 ml de 4% PFA / PBS e manter em gelo até que o esvaziamento está completo.
6. Corrigir os cérebros à temperatura ambiente durante 20 min: aplicar uma rotação suave, colocando os tubos Eppendorf em um rack e colocar o rack em um nutator.
7. Remover o fixadorusando um P-1000 micro-pipeta, adicionar 0,5 mL de 0,1% de Triton X-100/PBS, misturar por inversão e deixar incubar durante 1 min; repetir este passo de lavagem uma vez.
8. Remover o tampão de lavagem a partir da segunda, adicionar 0,5 mL de 0,1% de Triton X-100/PBS e deixar incubar à TA durante 20 min, repetindo este passo duas vezes.
9. Remover o tampão de lavagem e deixar os cérebros incubar em tampão de bloqueio (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 0,15 M, 0,1% de Triton X-100 e 0,5% de BSA) durante 1 hora à temperatura ambiente.
10. Incubar os cérebros com uma diluição de 1:100 de anticorpo anti-TH (consulte "Tabela de reagentes específicos") em solução de bloqueio, por dois dias, a 4 ° C, com rotação suave (veja o passo 2.6.).
11. Repita os passos de lavagem 2.7. e 2.8 ..
12. Equilibrar os cérebros com uma diluição 1:200 de uma solução de bloqueio antibodyin secundário, durante dois dias, a 4 ° C, com rotação suave.
13. Repita os passos de lavagem 2.7. e 2.8 ..
14. Preparar as lâminas de fixação, como ilustrado na Figura 2A:
    1. Add 2 X 25 gotas ul de meios de montagem para uma cobertura de vidro (24 x 60 mm, n. 1.5).
    2. Coloque dois copos de cobertura (tamanho 18 x 18 mm, não. 2) sobre os meios de montagem, deixando uma lacuna no meio do slide e deixe secar.
    Nota. Verifique o suporte de amostras no palco do seu microscópio confocal. Você pode fazer a tampa de vidro do mesmo tamanho de um x 75 mm Slide 25, anexando a 22 x 22 mm 1,5 tampa de vidro de uma das extremidades (usar unha polonês e fita).
15. Retire o tampão de lavagem, adicionar 50 mL de meios de montagem e permitir que os cérebros para equilibrar com ele por pipetagem cima e para baixo.
16. Utilizando um corte de P-200 a ponta da pipeta (ver passo 2.4), transferir os cérebros para a corrediça no espaço entre as duas lamelas e cobri-los com uma lamela não. 1.5 (ver Figura 2A, para orientar os cérebros no slide ver ^7).
    Observação: as amostras são montadas entre dois vidros de cobertura para permitir a visualização tanto do anterior e posterior lado do cérebro.
17. Preencher todo o espaço entre os vidros da tampa com meios de montagem; pipeta de um canto para retirar todo o ar e deixe secar e selar com unha polonês.
18. Para avaliar o número de neurónios dopaminérgicos em um conjunto específico adquirir uma série de secções ópticas ao longo do eixo z com um passo de 1,0 uM de tamanho utilizando um microscópio confocal (anatómica para a identificação de grupos dopaminérgicos no cérebro adulto de Drosophila ver ^7).

Resultados

Usamos os ensaios descritos aqui para estudar o papel do protector via Nrf2 o stress num modelo de Drosophila de DP ^14. Este modelo baseia-se na expressão do gene α-sinucleína humana em neurónios DA utilizando um condutor de Gal4 TH ^{2, 10.}

A Figura 1 mostra um resultado representativo de um sobressalto induzidas geotaxis negativos (subida) de ensaio nas moscas macho que expressam transgenes diferentes sob o controlo do controlador de TH Gal4. T...

Discussão

Os ensaios descritos aqui proporcionam uma abordagem útil para estudar o papel de genes específicos, as vias de sinalização ou de compostos pequenos na manutenção de neurónios DA em envelhecimento, bem como em diferentes fundos genéticos doenças ligadas (revisto em ^5).

O comportamento negativo geotaxis sobressalto induzida de Drosophila tem sido amplamente utilizada como um funcional leia-out para a funcionalidade do AD neurônios em diferentes origens genéticas, particula...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-tirosina hidroxilase de coelho	Millipore	AB152
Anticorpo anti-IgG de coelho marcado com TRITC de burro	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
Equipamento
Vials de poliestireno	VWR	89092-734	28.5 x 95 mm
Câmera digital	Canon	PowerShot A3100IS (modelo)	12.1 Megapixels 4X Zoom Óptico
Lâminas de cobertura de vidro nº 1.5	VWR	48366 205 48393 252	Tamanhos: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Lâminas de cobertura de vidro nº 2	VWR	48368-040	Tamanho: 18 x 18 mm
Pratos de dissecação	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Tamanho: 30 mm O.D.
Pinças Dumostar nº 5	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Estereomicroscópio	Carl Zeiss	Stemi 2000 (modelo)
Microscópio confocal	Leica	SP2 ou SP5 (modelo)
Tabela de Materiais.