Cultura primária Rat coletor medular interno células dos ductos

Resumo

Arginina-vasopressina (AVP) controla o ajuste fino da homeostase de água do corpo, facilitando a reabsorção de água pelas células principais renais. Aqui, apresentamos um protocolo para o cultivo de rato principal coletor medular interno células do duto adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à reabsorção de água AVP-mediada.

Resumo

Arginina-vasopressina (AVP), facilita a reabsorção de água por renal coletando células principais do duto e, assim, afina corpo homeostase da água. AVP se liga aos receptores de vasopressina V2 (V2R) na superfície das células e, assim, induz a síntese de cAMP. Este estimula a processos de sinalização intracelular que conduzem a alterações na fosforilação do canal de água aquaporina-2 (AQP2). Proteína cinase A phoshorylates AQP2 gerando assim a translocação de AQP2 de vesículas intracelulares para a membrana plasmática facilitar a reabsorção de água a partir da urina primária. Aberrações de libertação da AVP sinalização pituitária ou AVP-activado em células principais podem causar insipidus nefrogénica centrais ou diabetes, respectivamente, um nível elevado de AVP plasma sanguíneo está associada com doenças cardiovasculares, tais como insuficiência cardíaca crónica e síndroma de secreção inapropriada de hormona antidiurética.

Aqui, apresentamos um protocolo para cultivatino de rato principal coletor medular interno células do duto (IMCD), que expressa V2R e AQP2 endogenamente. As células são adequados para a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes ao controlo das AQP2 e, portanto, para descobrir novos alvos terapêuticos para o tratamento de doenças associadas com a desregulação da reabsorção de água mediada por AVP. IMCD células são obtidas a partir de ratos medulas interior renal e são utilizados em experiências de seis a oito dias após a semeadura. IMCD células podem ser cultivadas em placas de cultura de células normais, frascos e placas de micro-titulação de formatos diferentes, o procedimento requer apenas algumas horas, e é apropriado para laboratórios de cultura de células padrão.

Introdução

Na recolha de células renais de condutas principais, a arginina-vasopressina (AVP) controla a reabsorção de água, estimulando a inserção do canal de água aquaporina-2 (AQP2) na membrana plasmática. AVP se liga à proteína acoplada vasopressina tipo-2, receptor de G (V2R) estimular a adenilil ciclase e assim a formação de AMPc. Iniciação desta cascata de sinalização conduz à activação da proteína quinase A (PKA). PKA fosforila AQP2 na serina 256 (S256), que é o factor chave para a sua redistribuição intracelular de vesículas na membrana plasmática. A inserção da membrana facilita a reabsorção de água ao longo de um gradiente osmótico e afina corpo homeostase da água.

Desregulação da reabsorção de água AVP-mediada, devido a aberrações da secreção de AVP ou causas sinalização AVP ativados ou está associada a doenças graves. Diminuição da reabsorção de água causada por mutações de V2R ou AQP2 leva a diabetes insípido nefrogênico, enquanto um elevnível AVP plasma sanguíneo decido está associada a reabsorção excessiva de água em doenças cardiovasculares, como insuficiência cardíaca crônica ea síndrome da secreção do hormônio antidiurético inapropriado (SIADH).

O significado da reabsorção de água mediada por AVP resulta não só a partir da sua implicação na doença. A translocação AVP induzida por vesículas AQP2-rolamento e fusão com a membrana plasmática representa um processo exocitica estritamente cAMP-dependente, o que atualmente não é bem compreendida. Outros exemplos de um exocitose dependente de AMPc são a secreção de renina a nível renal, secreção de H ⁺ no estômago. Portanto, a elucidação dos mecanismos moleculares que regulam a AQP2-translocação em células renais principais não só ajuda a compreender os processos moleculares semelhantes em outros tipos de células, mas também pode abrir o caminho para novas terapias para o tratamento de doenças associadas a distúrbios da reabsorção de água mediada por AVP .

Elucidating AQP2 mecanismos de controle requer a coleta principais modelos de células do duto. Por isso, uma série de diferentes linhas de células de rim de mamífero estão disponíveis. No entanto, estes modelos têm vários inconvenientes. Em muitos sistemas de célula o nível de proteína AQP2 é baixa (Tabela 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) ^1-10, outros ectopicamente superexpressam humanos (MCD4, WT10) ou ^11,12 rato (CD8) ¹³ AQP2. Em MCD4 e células COS-7 do receptor V2 não é expresso. Para o nosso conhecimento, não há linha de células permanente como um modelo disponível, que é derivada da recolha da medula renal conduta interior, a parte do rim onde AQP2 expressão é mais abundante, mas a partir da conduta de recolha cortical ^1,11,13-16 . Tais modelos de células são por exemplo os mpkCCD imortalizada utilizada (por exemplo, ¹⁷⁾ ou os mTERT CCD ¹⁴ linhas de células recentemente estabelecidas. Ambas as linhas de células endogenamente AQP2 expressa e V2R, mas uma vez que eles são derivados daduto coletor cortical provavelmente conter um proteoma diferente em relação ao coletor medular interno células do duto (IMCD). Eles devem, por exemplo, expressar diferente Na ⁺ sistemas de transporte.

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura de células primárias IMCD expressando V2R e AQP2 endogenamente. Este modelo, portanto, representa mais de perto a situação fisiológica no ducto coletor renal. Como estabelecer a cultura exige apenas padrão de laboratório, equipamento de outros laboratórios podem facilmente adotar essa abordagem.

Protocolo

1. Preparação

1. Preparar os pratos de cultura
   1. Descongelar colagénio Tipo IV O / N a 4 ° C e dissolvem-se em 0,1% de ácido acético estéril. O volume a ser usado depende do tipo e número de pratos em que as células estão a ser semeadas. Use 2 mg / cm ^2.
   2. Incubar pratos, pelo menos durante 1 hora à temperatura ambiente e lava-se duas vezes com água destilada (A. tridest).
   3. Permitir que os pratos para secar adequadamente.
2. A suplementação do meio de
   1. Aumento do nível de glicose de até 4,5 g / l através da adição de 1,75 g de glicose a 500 ml de meio. Para ajustar o meio a 600 mosmol, adicionar NaCl 100 mM e 100 mM de ureia, para aumentar a osmolaridade de 200 mosmol e 100 mOsmol, respectivamente.
   2. Adicionar 1% de ácidos aminados não essenciais, 1% ultroser, dbcAMP 500 uM, 20 U / ml nistatina e 0,25 ug / ml de gentamicina (diluição 1:200 de uma solução de estoque com uma concentração de 50 ug / ml) a 600 mosmol meio DMEM frescos no dia da preparação.
3. Solução de enzima
   1. Adicionar 1 mg / ml de hialuronidase e 2,2 mg / ml de colagenase de DPBS contendo 0,25 ug / ml de gentamicina e nistatina. Prepare 1 ml desta solução de enzimas para a digestão de 2 rim medulas interior. A solução deve ser esterilizada por filtração e armazenada em tubos Falcon de 50 ml.

2. Cultivo de Rat primária ducto coletor medular interno (IMCD) Células

Todos os procedimentos de manuseio de animais devem ser realizadas em conformidade com a legislação local e federal.

1. Anestesiar ratos em CO ₂ (numa caixa saturado com CO ₂₎ e isoflurano (U-400 Anestesia unidade, Univentor Ltd., de Malta, fluxo de ar de 350-400 ml / min, com 2-2,5% de isoflurano). Decapitar os animais para o sangramento, que permite a detecção exata da fronteira entre a esbranquiçada interior ea medula externa mais escura. Além disso, a hemorragia minimiza o número de eritrócitos isolados. Remover e rinslavá-los em DPBS estéril suplementado com gentamicina e nistatina (ver acima) em gelo. Todas as outras etapas devem ser realizadas em condições bancada limpa estéreis.
2. Transferir os rins a partir da solução de DPBS para uma compressa esterilizada para remover o líquido em excesso. Retire a cápsula renal graxos com uma pinça e tesouras estéreis.
3. Tendo o rim ainda fixado na compressa, cortar ligeiramente ao lado do eixo longitudinal do lado exterior (cortical). Certifique-se de não cortar completamente, mas para deixá-lo em uma peça, conectado na pelve renal.
4. Com tesoura curva dissecar cuidadosamente o medulas interior esbranquiçada, que está cercado pela rosé cintilante medula externa. Recolhe-los em DPBS contendo gentamicina e nistatina em uma placa de cultura de 60 milímetros em gelo.
5. Uma vez que todos medulas são isoladas e recolhidas em gelo, reduzir o volume de DPBS para um nível em que são cobertos apenas com tampão. Use uma lâmina de barbear estéril para cortar o medulas em cubos de 5³ mm.
6. Derreta e volta a ponta de uma pipeta Pasteur estéril, segurando-o brevemente em uma chama. Certifique-se que a pipeta é resfriado antes de continuar.
7. Transferir a suspensão de tecido para os tubos Falcon de 50 ml contendo solução de enzima esterilizada preparados com hialuronidase e colagenase (ver 1.3.1), usando o arredondado pipeta Pasteur. Fechar hermeticamente a tampa e incubar a 37 ° C, sob agitação contínua (220 rpm) num banho de água de mesa regular para 1,5-2 horas.
8. Por trituração da suspensão, pipetar a mistura para cima e para baixo várias vezes, com a pipeta de Pasteur rodada (veja acima) até a suspensão se tornar homogénea turva.
9. Centrifugar a suspensão durante 5 min a 300 xg e 16 ° C. Rejeitar o sobrenadante, ressuspender o pellet cuidadosamente em DPBS contendo gentamicina e nistatina e centrifugar novamente. Repetir esta etapa de lavagem uma vez.
10. Ressuspender as células em meio totalmente completada e semente-los em cultura pratos e / ou chapas de microtitulação assim. A preparação de 2 medulas (1 animal) irá produzir células suficientes para um prato de cultura de 60 mm.
11. Após 24 horas, lave as células duas vezes com 600 mosmol DMEM e adicione meio fresco. Durante a semana seguinte as células deverão ser lavadas 2-3 vezes (Figura 1). 6-8 dias após a sementeira, as células IMCD pode ser utilizado para experiências. Recorde incubar em meio sem dbcAMP e nistatina durante 24 horas antes de começar a experiência. Caso contrário AQP2 será exclusivamente localizado na membrana de plasma.

Resultados

O sucesso do cultivo de células primárias de rato IMCD resultará numa monocamada confluente de 6-8 dias após a sementeira (Figura 2). Por 60 milímetros prato de cultura há aproximadamente 6 x 10 ⁶ células. As células firmemente aderir às placas de cultura, uma vez que estes foram revestidos com colagénio do tipo IV, um componente da membrana basal ^18. Portanto, as células IMCD não irá separar mesmo durante vários procedimentos de lavagem cuidadosa. Até 80% das células cultivadas ex...

Discussão

Nós apresentamos um protocolo detalhado para a preparação e cultivo de células IMCD primárias de rato. A abordagem rende até 21 cm ² de células de um rato ^20. O ensaio requer um equipamento padrão de cultura de células e pode ser realizada por uma única pessoa dentro de aproximadamente 6 horas. Por conseguinte, esta abordagem é adequada como um método padrão de laboratório.

IMCD células primárias de rato podem ser semeadas em placas de cultura de diferentes tamanhos, qu...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
biosciences	do BD do rato do tipo IV do colagênio	356233
tipo CLS-II da colagenase
DMEM + GlutMAX	Invitrogen GIBCO	21885108
a nistatina	SIGMA	N4014
Aminoácidos não essenciais (NEA)	Biochrom AG	K0293
Gentamicina	Invitrogen GIBCO	15710
DBcAMP	BIOLOG	D009

Tipo o SIGMA H6254 Biochrom AG C2-22 Ultroser G Cytogen 15950-017