Microscopia correlativo para Análise Estrutural 3D de interações dinâmicas

Resumo

Nós descrevemos um método de microscopia correlativa que combina alta velocidade de microscopia de luz fluorescente de células vivas 3D de alta resolução tomografia crio-eletrônico. Nós demonstrar a capacidade do método dinâmico de imagem por correlativo, as pequenas partículas de HIV-1 que interagem com células HeLa hospedeiras.

Resumo

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) permite a visualização em 3D de estruturas celulares com resolução molecular em um estado próximo do fisiológico ^1. No entanto, a visualização directa de complexos virais individuais no seu ambiente celular do hospedeiro com cryoET é um desafio ^2, devido à natureza pouco frequentes e dinâmica de entrada viral, especialmente no caso do VIH-1. Enquanto lapso de tempo de imagem de células vivas produziu uma grande quantidade de informações sobre muitos aspectos do ciclo de ^HIV-janeiro 03-07 de vida, a resolução oferecida por microscopia de células vivas é limitado (~ 200 nm). Nosso trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um método de correlação que permite a visualização direta dos eventos iniciais da infecção pelo HIV-1 pela combinação de microscopia de luz fluorescente de células vivas, crio-microscopia fluorescente e cryoET. Deste modo, os sinais vivo de células e crio-fluorescente pode ser utilizada para orientar a amostragem de precisão cryoET. Além disso, a informação estrutural obtida a partir de cryoET pode be complementado com os dados funcionais dinâmicos adquirida através de imagens ao vivo de células de alvo marcado fluorescente.

Neste artigo de vídeo, nós fornecemos métodos detalhados e protocolos para investigação estrutural do HIV-1 e interações célula hospedeira usando imagens ao vivo de células em 3D correlativo de alta velocidade e análise estrutural cryoET de alta resolução. As células HeLa infectadas com o HIV-1 partículas foram caracterizadas pela primeira vez por microscopia confocal em células vivas, e a região contendo a mesma partícula viral foi então analisado por tomografia crio-electrónica para detalhes estruturais 3D. A correlação entre dois conjuntos de dados de imagem, de imagem óptica e eletrônica de imagem, foi realizada através de microscopia de luz fase crio-fluorescência construídos em casa. A abordagem aqui pormenorizadas serão úteis não só para o estudo das interacções das células do vírus-hospedeiro, mas também para várias aplicações em biologia celular, tais como sinalização, o tráfico de receptor de membrana da célula, e em muitos outros processos celulares dinâmicas. </ P>

Introdução

Tomografia crio-eletrônico (cryoET) é uma técnica de imagem poderosa que permite a visualização tridimensional (3D) de células e tecidos e fornece insights sobre a organização de organelas nativas e estruturas celulares com resolução molecular em um de perto o estado fisiológico ^1. No entanto, a natureza inerentemente não corado de baixo contraste amostra congelada-hidratado, combinada com a sua sensibilidade à radiação, torna difícil localizar áreas de interesse dentro de uma célula e, subsequentemente, realizar a série de inclinação com êxito, sem danificar a zona alvo. A fim de superar estes problemas, uma abordagem que combina correlativo microscopia ó....

Protocolo

1. Cultura de células HeLa em revestido de carbono, EM Localizador Grids ouro

1. Descarga luminescente do lado de carbono de um R2 de 200 mesh / 2 Quantifoil ouro EM localizador grade com menos de 25 mA para 25 seg.
2. Brasão da grade EM com fibronectina, flutuando-lo, do lado do carbono para baixo, em uma gota de 40 mL de 50 mg / ml solução fibronectina, em seguida, desinfectá-lo sob a luz UV por 2 horas em uma capa de cultura de tecidos.
3. As células HeLa placa na grade a uma densidade de 2 x ⁴ 10 células / ml (total de 2 ml de cultura) em uma placa de cultura de vidro de fundo e crescer as células a 37 ° C, com 5% de _CO2,

Resultados

Para caracterizar o comportamento dinâmico das partículas de vírus, as células HeLa infectadas com o HIV-1 foram visualizados por meio de microscopia confocal de células vivo de alta velocidade e os movimentos das partículas foram analisadas por rastreamento automatizado de partículas 3D (Figura 1). Para evitar que o lapso de tempo de vários minutos, que pode ocorrer entre a colheita da última imagem ao vivo de células confocal e de imersão de congelação (o que pode ser suficiente para perder correlacio.......

Discussão

Nós apresentamos um conjunto simples de protocolos para fornecer uma abordagem correlativa avançada para analisar eventos celulares dinâmicos usando time-lapse imagens de fluorescência confocal, em células vivas seguido por cryoET. Nosso desenvolvimento metodológico para correlacionar a imagem ao vivo de células em 3D com alta resolução cryoET é fundamental para investigar muitos problemas biológicos desafiadoras, tais como a visualização, dinâmico (não estático, como relatado anteriormente), e difração limitada partícu.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
DMEM 4,5 g/L Glicose com L-Glutamina	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectina	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	Cultura de células HeLa em grades EM
Rastreador de células	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Conjugados
	de ouro da proteína A CMTPX vermelhaTed Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diâmetro
0,2 μ m microesferas fluorescentes	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Fluorescência amarelo-esverdeada
Soro fetal bovino de bezerro inativado por calor	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Prato de cultura com fundo de vidro	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Localizador de quantifoil de ouro EM grades	Quantifoil Micro Tools, Jena, Alemanha	R2 / 2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment< / strong>
Dispositivo de descarga de brilho 100X	EMS, Hatfield, PA
Microscópio eletrônico Tecnai Polara G2 com uma pistola de emissão de campo	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
microscópio Olympus IX 71	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (distância de trabalho de 2.7-4 mm) lente objetiva
Nikon TiE microscópio Nikon	Instruments, Melville, NY		usando uma lente objetiva de imersão em óleo 60X/1.35 NA
Microscópio confocal Sweptfield	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Atingiu a câmara de célula viva	Tóquio, Japão
Estágio de amostra de criofluorescência	Feito		casa Construído em casa por oficina mecânica, consulte a referência 15 para o design.

em