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5/6th Nephrectomy em combinação com uma dieta alta de sal e Óxido Nítrico Sintase inibição para induzir o Doença Renal Crônica no Rato Lewis

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DOI:

10.3791/50398

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3 de julho de 2013

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

Neste artigo

Resumo

Um método de duas fases para estabelecer a doença renal crónica (IRC) em ratos Lewis por remoção cirúrgica da massa renal 5/6th é descrito. Combinação do procedimento cirúrgico, NOS-inibição e uma dieta rica em sal leva a um modelo semelhante CKD humano, permitindo estudo dos mecanismos causais e desenvolvimento de intervenções terapêuticas.

Resumo

A doença renal crônica (DRC) é um problema global. Retardar a progressão da doença renal crônica é uma das principais prioridades de saúde. Desde DRC é caracterizada por desarranjos complexos de homeostase, os modelos animais integrativos são necessárias para estudar o desenvolvimento e progressão de DRC. Para estudar o desenvolvimento de intervenções terapêuticas com DRC e romance em CKD, usamos o modelo de ablação nefrectomia 5/6th, um modelo experimental bem conhecido de doença renal progressiva, assemelhando-se vários aspectos da CKD humano. A redução bruta da massa renal provoca glomerular progressiva e lesão túbulo-intersticial, perda de néfrons remanescentes e desenvolvimento de hipertensão arterial sistêmica e glomerular. Também está associada com a perda progressiva intra capilar, inflamação e glomeruloesclerose. Fatores de risco para DRC invariavelmente impacto sobre a função endotelial. Para simular isso, nós combinamos remoção de 5/6th da massa renal com o óxido nítrico (NO) exaustão e uma dieta rica em sal. Após a chegada e aclimatação, os animais receber um inibidor da sintase de NO (NG-nitro-L-arginina) (L-NNA), suplementado com a água de beber (20 mg / L) durante um período de 4 semanas, seguido de uninefrectomia no lado direito. Uma semana mais tarde, uma nefrectomia subtotal (SNX) é realizada no lado esquerdo. Após SNX, os animais são deixados a recuperar durante dois dias seguidos por LNNA na água de beber (20 mg / L) por um período adicional de 4 semanas. Uma dieta rica em sal (6%), complementado em terra de comida (veja linha do tempo Figura 1), continua durante todo o experimento. A progressão da insuficiência renal é seguida ao longo do tempo medindo a ureia plasmática, pressão arterial sistólica e proteinúria. Por seis semanas após SNX, insuficiência renal desenvolveu. A função renal é medida usando inulina "padrão ouro" e ácido para-amino hipúrico (PAH), tecnologia de apuramento. Este modelo de DRC é caracterizada por uma redução na taxa de filtração glomerular (TFG) e do fluxo plasmático renal eficaz (FPER), hipertensão (pressão sanguínea sistólica> 150 mm Hg), a proteinúria (> 50 mg/24 hr) E uremia leve (> 10 mM). As características histológicas incluem danos túbulo-intersticial reflectida pela inflamação, atrofia tubular, e fibrose e glomeruloesclerose focal conduzindo a enorme redução dos glomérulos saudáveis ​​na população remanescente (<10%). Follow-up até 12 semanas após SNX mostra a progressão da DRC.

Introdução

Devido ao seu caráter progressivo, resultante final da doença renal em estágio, e morbidade cardiovascular e mortalidade associadas, DRC é um problema crescente de saúde pública 1. Retardar a progressão da doença renal crônica é, portanto, uma prioridade de saúde. Desde DRC é caracterizada por desarranjos complexos de homeostase, os modelos animais integrativos são necessárias para estudar o desenvolvimento e progressão de DRC. O rim é composto de uma ampla gama de diferentes tipos de células que interagem uns com os outros. Esta complexidade não pode ser mimetizado in vitro.

Para estudar as intervenções terapêuticas em CKD, usamos o modelo 5/6th nefrectomia ablação, um modelo experimental bem conhecido de doença renal progressiva, assemelhando-se vários aspectos da CKD humano 2,3. A redução bruta da massa renal provoca glomerular progressiva e lesão túbulo-intersticial, perda de néfrons remanescentes e desenvolvimento de hipertensão arterial sistêmica e glomerular. Ela está associada com progrperda essive intrarenal capilar 4, inflamação e glomeruloesclerose. Fatores de risco para DRC invariavelmente impacto sobre a função endotelial 5. Usamos uma estirpe de rato (Lewis) que é relativamente resistente ao desenvolvimento de DRC e, portanto, a remoção combinada de 5/6th da massa renal com óxido nítrico (NO) depleção 6, 7, 8 e uma dieta rica em sal 9. Após a chegada e de aclimatação, os animais recebem um inibidor da NO-sintase (L-NNA), suplementado com a água de beber (20 mg / L) durante um período de 4 semanas, seguido de uninefrectomia lado direito (UNX), com continuação da L-NNA após dois dias . Uma semana depois, a nefrectomia subtotal (SNX), ou seja remoção de 2/3rds de massa renal é realizado no lado esquerdo. Após SNX, os animais são deixados a recuperar durante 2 dias, seguido novamente por 20 mg / L na água de beber LNNA por um período de 4 semanas. Uma dieta rica em sal (6%), complementado em terra de comida (veja linha do tempo Figura 1), continua durante todo o experimento. Tele razão para realizar o UNX no lado direito e a SNX no lado esquerdo é que os vasos renais são mais longos no lado esquerdo, que torna mais fácil o acesso ao rim sem esticar os vasos muito quando o rim é exposto fora do corpo . Na literatura, os modelos são descritos em que os pólos do rim esquerdo são removidos em primeiro lugar, seguido por UNX do rim direito, uma semana depois 10,11,12. Nas nossas mãos este modelo mostrou um desenvolvimento muito mais rápido de insuficiência renal, mas também uma variação muito maior na perda da função renal. A progressão da insuficiência renal é seguida ao longo do tempo medindo a ureia plasmática, pressão arterial sistólica e proteinúria. Por seis semanas após SNX, insuficiência renal desenvolveu, caracterizada pela diminuição acentuada na taxa de filtração glomerular (69%) e do fluxo plasmático renal eficaz (62%) 13 de hipertensão (pressão sanguínea sistólica> 150 mm Hg), a proteinúria (> 50 mg/24 hr) e leve uremia (> 10 mM). Características histológicas incluem Tubuldanos o-reflectida pela inflamação intersticial, atrofia tubular e fibrose e glomeruloesclerose focal conduzindo a enorme redução dos glomérulos saudáveis ​​na população remanescente (<10%). Follow-up até 12 semanas após SNX mostra a progressão da DRC, proporcionando uma janela de oportunidade para a avaliação de intervenções terapêuticas.

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Protocolo

Todos os experimentos são executados de acordo com as linhas de orientação éticas animais experimentais da comissão de animal experimental Utrecht. O protocolo é realizada sob a orientação e aprovação dos cuidados com os animais da instituição do autor e da comissão de uso.

DRC é induzida em ratos Lewis consanguíneos machos (Charles River, Sulzfeld, Alemanha) com a idade de 8 semanas. Os ratos são alojados sob condições padrão num ambiente, luz, temperatura e humidade controlada.

1. Preparação da cirurgia

  1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos:
    • Um tecido estudante forceps 1-2 dentes de 12 centímetros
    • Um estudante fórceps padrão normal
    • 2 Semken forceps
    • Uma tesoura de Mayo
    • Um estudante tesoura iris
    • Um porta-agulha Olsen-Hegar com tesoura
    • Cobertor
  2. Confira lista de inventário:
    • Mesa de operação com almofada de aquecimento e lâmpadas
    • O 2, isoflurano
    • Tecidos
    • Barbeador
    • Balança
    • Conjunto operacional estéril
    • 5x5 gaze estéril e 10x10
    • Álcool a 70%
    • Solução de NaCl a 0,9%
    • Seringa de 1 ml
    • Agulhas (25G)
    • Gel almofadas de espuma: Spongostan
    • Vicryl 4.0 e 5.0
    • A buprenorfina 0,03 mg / kg (1:10 diluído em salina fisiológica)
    • Gaiola limpa para ratos após cirurgia

2. Direito uninefrectomia Side

  1. Desinfetar a mesa com álcool 70%.
  2. Lugar rato na caixa de indução e induzir a anestesia com 4% de isoflurano e um fluxo litro de O 2. Nota: dependendo da estirpe de ratos utilizada, pré e peri-operatório analgesia são prescritos, isso precisa ser discutido com o veterinário local.
  3. Transferir rato para mesa e lugar nariz em cone. O cone de nariz e de rato são colocados numa almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal do rato. O rato is ventilados com uma mistura de 2% de isoflurano e 1 litro de O 2.
  4. Raspar o flanco do rato e desinfecção com álcool. Lavar e desinfectar as mãos e usar luvas cirúrgicas estéreis. Usar uma touca de cabeça e uma máscara. Faça por 1 - 1,5 centímetros incisão paralela às costelas usando uma pinça e tesouras sem corte anatômico. Expor o rim por dissecção romba dos músculos das costas.
  5. O pólo inferior do rim é visível, use com cuidado as pequenas pinças contundentes para prender o tecido adiposo perirenal. Exteriorizar o rim, puxando suavemente sobre a gordura perirenal com uma pinça. Tome cuidado para não perturbar a glândula adrenal durante este procedimento. A glândula supra-renal pode ser facilmente removido por uma pinça de colocação no local medial e no tecido adiposo e movido suavemente para cima entre a glândula supra-renal e do rim, conforme ilustrado na Figura 2.
  6. Coloque renal suavemente sobre gaze e clara em torno do tecido adiposo e conjuntivo. Identificar a artéria renal e veia e colocar uma ligadura (5.0vicryl) com um único nó ao redor dos vasos, mas não amarrar o nó.
  7. Mova o nó frouxo cuidadosamente ao longo dos vasos em direção à aorta por aproximadamente 0,5 cm, para criar espaço entre o rim eo nó. Isto é feito para evitar que a ligadura de escorregar após o corte.
  8. Amarrar o nó com dois nós de casal. Se a perfusão é interrompida, a cor do rim mudará imediatamente para castanho. Não corte as extremidades da ligadura.
  9. Cortar os vasos renais próximos do rim e remover o rim. Puxe delicadamente as longas extremidades da ligadura para verificar se há sangramento dos vasos renais. A ligadura deve permanecer no local na embarcação. Corte as extremidades longas da ligadura. Note, os vasos renais remanescentes será recolhido para dentro da cavidade abdominal imediatamente.
  10. Blot rim retirado secar e pesar.
  11. Fechar a incisão do músculo esquelético com o funcionamento de suturas com Vicryl 5.0. Injectar 0,10 ml (0,03 mg / kg), a buprenorfina im no membro posterior. Feche apele com Vicryl 4.0 com sutura intradérmica. Isto impede que os ratos de abertura da ferida. Nota: devido à depressão respiratória em ratos Lewis, que só dão analgesia pós-operatória, pouco antes de desligar o isoflurano.
  12. Abrigar o rato em uma gaiola solitária limpo com fácil acesso à comida e água. Coloque a gaiola metade sobre o aquecimento pad O / N e verifique o rato cuidadosamente no dia seguinte. Quando a ferida é fechada e o rato é activo, que é, normalmente, compreendida entre 6 e 12 horas após a cirurgia, os ratos podem ser colocados de volta no alojamento de grupo.

3. Lado Esquerdo nefrectomia subtotal

  1. Sete dias depois, as mesmas preparações são feitas no lado esquerdo como para o lado direito, tal como descrito 2,1-2,5. Antes da cirurgia, é calculada a quantidade de tecido renal, que precisa de ser removido correspondente a aproximadamente 2/3RDS do peso do rim direito. Prepare a pequenos pedaços de espuma de gel (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) antes da cirurgia.
  2. Coloque uma tesoura afiada em torno do pólo superior do rim esquerdo e ressecar o pólo superior de um acidente vascular cerebral (para localização tesoura, ver Figura 3). Cubra imediatamente com um pedaço de espuma de gel e de exercer uma pressão ligeira com uma gaze estéril.
  3. Repita com o pólo inferior do rim como em 3.3.
  4. Elevador rim para impedir a coagulação na pele. Manter a pressão suave em ambos almofadas de espuma de gel com gaze estéril até parar de sangrar. Quando o sangramento persistir, adicionar uma outra almofada de espuma.
  5. Coloque o restante do rim com almofadas de espuma de gel aderente dentro do abdômen. Feche o músculo ea pele e siga 2,9-2,12.

4. Sham Cirurgia

  1. Sham controles operados submetidas ao mesmo procedimento, a fim de expor os rins. Em vez de extirpar o rim ou o corte dos pólos, uma semana depois, ambos os rins estão decapsulated em um intervalo de uma semana, tomando cuidado para não perturbar as glândulas supra-renais. Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios são identical a 2.11 e 2.12.

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Resultados

Após a nefrectomia subtotal, aproximadamente 1/6th da massa renal total é para a esquerda. Figura 4 mostra o peso da parte removida do rim direito com média e desvio padrão, em duas experiências anteriores. Deve-se ter em mente que, durante a semana depois da UNX, hipertrofia do rim esquerdo ocorre, indicando que o peso que deve ser removido calculado com base no peso do rim direito sempre resulta em menos do que a remoção 5/6th. No entanto, uma vez que não é possível determinar o peso do rim esquerdo d...

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Discussão

A remoção cirúrgica do 5/6th da massa renal em ratos Lewis, combinada com uma dieta rica em sal e inibição temporária NOS leva a um modelo de doença renal crônica que se assemelha CKD humana e permite o estudo dos mecanismos causais e eficácia de intervenções terapêuticas em CKD.

O modelo de nefrectomia 5/6th é um modelo bem conhecido e descrito extensivamente para DRC. No entanto, a simples remoção 5/6th da massa renal não levar à insuficiência renal imediato em todas as cepas de ratos. Usa...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Agradecemos Krista den Ouden pelo seu excelente assistência técnica. Esta técnica foi apoiado financeiramente pela Fundação do Rim holandês, concessão C06.2174. MCV é apoiada pela organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO) Vidi-concessão 016.096.359.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
   Reagente
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan dental: almofadas de espuma de gel 1x1x1 cmJohnson& JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
Buprenorfina (0,3 mg/ml)Através de farmacêutico local encomendado pela Reckitt Benckiser pharmaceuticalsdesconhecido 
   Equipamento
Pinça de Tecido para Estudantes - 1x2 Dentes 12 cmFerramentas de Ciência Fina (FST)91121-12 
Fórceps Padrão de EstudanteFST91100-12 
Tesoura MayoFST14010-15 
2X Pinças SemkenFST11008-13 
Tesoura de Estudante IrisFST91460-11 
Porta-agulhas Olsen-HegarFST12002-14 

Referências

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