A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Catheleyne D'hondt; Bernard Himpens; Geert Bultynck

doi:10.3791/50443

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Artigo de método

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

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DOI:

10.3791/50443

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16 de julho de 2013

Catheleyne D'hondt¹ , Bernard Himpens¹ , Geert Bultynck¹

¹Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

Neste artigo

Resumo

Intercelular Ca^{2 +}-Ondas são conduzidos por canais de junção gap e hemichannels. Aqui, descrevemos um método para medir intercelular Ca^{2 +}-Ondas em monocamadas de células em resposta a um estímulo mecânico de uma única célula local e sua aplicação a investigar as propriedades e regulação dos canais de junções gap e hemichannels.

Resumo

Comunicação intercelular é essencial para a coordenação dos processos fisiológicas entre as células de uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o cérebro, o fígado, a retina, na cóclea e vasculatura. Em condições experimentais, intercelular Ca ^{2 +-ondas} pode ser obtida através da aplicação de um estímulo mecânico para uma única célula. Isto conduz à libertação das moléculas sinalizadoras intracelulares de IP ₃ e Ca ^{2 +} que iniciam a propagação do Ca ^{2 +} onda concêntrica a partir da célula estimulada mecanicamente para as células vizinhas. As principais vias moleculares que controlam intercelular Ca ^{2 +} propagação de ondas são fornecidos por canais de derivação lacuna através da transferência direta de IP ₃ e por hemichannels através da liberação de ATP. A identificação e caracterização das propriedades de regulação e das diferentes isoformas de conexinas e pannexin como canais de junções de hiato e hemichannels são permitidas pelo quantification da disseminação intercelular do Ca ^{2 +} onda, siRNA, e o uso de inibidores dos canais de junções de hiato e hemichannels. Aqui, nós descrevemos um método para medir intercelular Ca ^{2 +} onda em monocamadas de células endoteliais da córnea primárias carregado com Fluo4-AM em resposta a um estímulo mecânico controlado e localizado provocado por uma deformação aguda de curta duração, da célula como resultado de tocar na membrana celular com uma micropipeta de vidro controlada por micromanipulador com um diâmetro de ponta de menos de 1 um. Descrevemos também o isolamento de bovinos células endoteliais corneanas primários e sua utilização como sistema modelo para avaliar a atividade Cx43-hemichannel como a força orientada para intercelular Ca ^{2 +-ondas} através da liberação de ATP. Finalmente, discute-se a utilização, vantagens, limitações e alternativas deste método no contexto do canal de junção gap e pesquisa hemichannel.

Introdução

Comunicação intercelular e de sinalização são essenciais para a coordenação dos processos fisiológicos em resposta aos agonistas extracelulares no tecido e nível de ^1,2-órgão inteiro. A maneira mais direta de comunicação intercelular é criado pela ocorrência de junções. Junções são placas de canais de junção gap, que são canais protéicos formados pelo acoplamento cabeça-de-cabeça de dois (Cx) hemichannels conexina de células adjacentes ^3,4 (Figura 1). Junções de hiato permitir a passagem de pequenas moléculas de sinalização, com um peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluindo Ca ^{2 +} ou de IP ₃ ^5,