Isolamento de Células Embrionárias ventriculares endoteliais

Resumo

Cultura celular primária é uma técnica útil para a análise de populações específicas de células, principalmente a partir de embriões de camundongos transgênicos em estágios de desenvolvimento específicos. Nisto, os ventrículos embrionárias são dissecados e dissociados, e os grânulos de anticorpos conjugados reconhecer e separar as células endoteliais para análise posterior.

Resumo

Cultura de células tem melhorado muito a nossa capacidade de avaliar populações individuais de células sob condições de cultura inumeráveis. Enquanto as linhas de células imortalizadas oferecem vantagens significativas para a sua facilidade de utilização, estas linhagens de células não estão disponíveis para todos os tipos de células potenciais. Ao isolar as células primárias a partir de uma região específica de interesse, particularmente a partir de um ratinho transgénico, os estudos mais matizadas podem ser executadas. A técnica básica envolve a dissecção do órgão ou órgãos parcial de interesse (por exemplo, do coração ou de uma região específica do coração) e dissociação do órgão para células individuais. Estas células são então incubadas com contas magnéticas conjugadas com um anticorpo que reconhece o tipo celular de interesse. As células de interesse pode então ser isolado, com a utilização de um íman, com uma curta incubação de tripsina dissociar as células dos grânulos. Estas células isoladas podem ser cultivadas e, em seguida, analisado como desejado. Esta técnica foi originalmente concebido para órgão do rato adultos, mas podem ser facilmente reduzidos para uso com os órgãos embrionários, como aqui demonstrado. Porque o nosso interesse é na vasculatura coronária em desenvolvimento, que queria estudar esta população de células em fases embrionárias específicas. Assim, o protocolo original teve de ser modificado para ser compatível com a pequena dimensão dos ventrículos embrionárias e o baixo rendimento potencial das células endoteliais para estas fases de desenvolvimento. Utilizando essa abordagem em escala reduzida, avaliamos coronária remodelação plexo nas células endoteliais ventriculares embrionárias transgênicos.

Introdução

O advento das linhas de células imortalizadas revolucionou a biologia das células de base ^1. As linhas de células actualmente disponíveis são derivados de uma vasta gama de órgãos e abrangem todos os principais tipos de células. No entanto, as linhas celulares estabelecidas têm algumas limitações. O processo de imortalizao, obviamente, alterar o comportamento das células, especialmente no que diz respeito ao tempo de vida e a proliferação, mas também pode afectar a expressão de proteínas inesperadas, tais como as proteínas do citoesqueleto ^2. Além disso, apesar de muitas linhas celulares diferentes estão disponíveis, existe uma diversidade signi....

Protocolo

1. Preparar anticorpos conjugados grânulos

1. Um dia antes da dissecação, combinar o anticorpo de escolha com as Dynabeads apropriadas (por exemplo IgG de rato Dynabeads para um anticorpo criado em ratos, 4 x 10 ⁸ contas / ml), segundo as instruções do fabricante. Para o rato anti-CD31 anticorpo BD (0,5 mg / mL, utilizados para isolar as células endoteliais), 3 ul de anticorpo é adicionado a cada 25 ul de pérolas, para uma concentração final de 1,5 ug de anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 ⁷ esferas / 25 ul de tampão.
2. Incube os grânulos e de anticorpos durante a noite a 4 ° C.

2. Preparando o ....

Resultados

Usando um anticorpo específico para o endotélio, que reconhece CD31, as células endoteliais foram isolados a partir dos ventrículos embrionárias (E), 13,5 (Figura 1A) e 18.5 (Figuras 1B-1D) embriões. Quando cultivado em um prato de cultura não tratada, essas células permanecem arredondado e que formam um padrão de paralelepípedos se perto confluente (Figura 1A). Diluir colagénio também foi utilizado para revestir os poços, e as células endoteliais, enquanto vai aderir a.......

Discussão

Trabalhando com células embrionárias primárias permite novas experiências para abordar em passos críticos do desenvolvimento in vitro. No entanto, o procedimento de isolamento não é trivial. Passos críticos para o isolamento de qualquer tipo de células, nomeadamente, assegurar que as células são bem separados por digestão com colagenase e depois que eles são bem suspensa durante os passos de lavagem. Dissecção mecânica por pipetagem contribui grandemente separar as células durante a etapa de colagenase.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
REAGENTS
Timed-pregnant Camundongos			serem dissecados no estágio embrionário de interesse
Anti-camundongo CD31	BD Bioscience	553370
Rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Colágeno	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Colagenase, tipo I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Meio de crescimento de células endoteliais	(feito em laboratório conforme descrito nas notas)		DMEM contendo 20% de FBS, 5 μ M β-mercapt– thanol, 50 μ g/ml de ECG e 1x penicilina/estreptomicina
β-mercapt– thanol	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Biomedical Technologies, Inc.	BT-203
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140
Tripsina-EDTA	Gibco	25300
Placa de cultura de 384 poços	Greiner	T-3037-6	A placa foi preparada com um gel de colágeno fino, conforme descrito em 6; área de superfície de trabalho 10 mm2
Colágeno tipo I	BD	354236	Uso final concentração de 1,5 mg/ml
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Usado conforme indicado em 13
EQUIPMENT
Microscópio estereoscópico	Nikon	SMZ645
Incubadora de cultura de células	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Centrífuga de mesa	Thermo	75002430

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