Medir as propriedades mecânicas das células vivas Usando Microscopia de Força Atômica

Resumo

Este documento revela um protocolo para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas por meio de microindentação utilizando um microscópio de força atómica (AFM).

Resumo

As propriedades mecânicas das células e da matriz extracelular (ECM) desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos, incluindo a diferenciação de células estaminais, a formação de tumores e cicatrização de feridas. Alterações na rigidez de células e de ECM são frequentemente sinais de alterações na fisiologia da célula ou doenças em tecidos. Assim, a rigidez da célula é um índice para avaliar a qualidade de culturas de células. Entre a multiplicidade de métodos aplicados para medir a rigidez das células e tecidos, micro-recuo usando um Microscópio de Força Atômica (AFM) fornece uma maneira de medir de forma confiável a rigidez das células vivas. Este método tem sido amplamente utilizado para caracterizar a rigidez em micro-escala de uma variedade de materiais que vão desde as superfícies metálicas para os tecidos moles e as células biológicas. O princípio básico deste método é recuar um celular com uma ponta do AFM da geometria selecionada e medir a força aplicada a partir da flexão do cantilever AFM. Montagem da curva força-recuo para o modo de Hertzl para a geometria da ponta correspondente pode dar medições quantitativas de rigidez do material. Este documento revela o procedimento para caracterizar a rigidez de células vivas utilizando AFM. Etapas-chave, incluindo o processo de AFM calibração, aquisição de força curva, e análise de dados usando uma rotina MATLAB são demonstrados. As limitações deste método também são discutidos.

Introdução

As propriedades mecânicas, em especial a rigidez, de células individuais e as suas áreas de matrizes extracelulares (ECM) são críticos para muitos processos biológicos incluindo o crescimento celular, motilidade, divisão, diferenciação e na homeostase de tecido. ^Uma Foi demonstrado que a rigidez mecânica da célula é determinada principalmente pela do citoesqueleto, em particular as redes de filamentos de actina e intermédios e outras proteínas associadas a eles. ² Resultados dos testes mecânicos nas redes em in vitro de filamentos de actina e intermediários sugerem que os mecanismos celulares é em grande parte dependente da estrutura do citoesqueleto e a pré-tensão no o citoesqueleto. ^3-5 Rigidez de células vivas é então considerado como um índice para avaliar a estrutura do citoesqueleto ^{6, 7} e actividade miosina muitos outros processos celulares. Mais importante ainda, as alterações nas propriedades mecânicas das células são também frequentemente encontrado para ser estreitamente associadaciado a várias condições de doença, tais como a formação de tumores e metástases ^8-10 Controlo da rigidez mecânica de células vivas podem, portanto, proporcionar uma nova forma de controlar a fisiologia da célula,. de detectar e diagnosticar doenças ^8,. e para avaliar a eficácia dos tratamentos com medicamentos ^{11 , 12}

Vários métodos, incluindo microrheology partícula de rastreamento, ^13-16 citometria de torção magnética, ¹⁷ micropipeta aspiração microindentação ^18,19 e ^20-22 foram desenvolvidos para medir a elasticidade das células. Partícula de rastreamento microrheology traça as vibrações térmicas, tanto de partículas submicrométricas fluorescentes injectados em células ou marcadores fiduciais dentro do citoesqueleto celular. ²³ propriedades elásticas e viscosas de células são calculados a partir dos deslocamentos de partículas medidos usando o teorema de dissipação de flutuação. ^14,23 Este método permite medições simultâneas de locaispropriedades mecânicas com alta resolução espacial em diferentes lugares em uma célula. No entanto, a injeção de partículas fluorescentes em células pode levar a alterações na função celular, a estrutura do citoesqueleto, e, portanto, a mecânica da célula. O método aplica-se a aspiração de pressão negativa micropipeta em uma micropipeta de diâmetro variando entre 1 e 5 um para chupar um pequeno pedaço de membrana celular para a pipeta. Rigidez das células é calculada a partir da pressão negativa aplicada e deformação da membrana celular. ¹⁸ Este método, no entanto, não é possível detectar a distribuição heterogénea da rigidez em toda a célula. Citometria de torção magnética (MTC) se aplica o campo magnético para gerar binário em grânulos super-paramagnéticas ligadas à membrana celular. Celular rigidez ¹⁷ é derivado no presente método a partir da relação entre o binário aplicado e a deformação de torção da membrana celular. É difícil controlar a localização das esferas magnéticas no método MTC, e é também challenging a caracterizar a deformação de torção, com alta resolução. Microindentação aplica um penetrador com uma geometria bem definida, para perfurar na célula. A força de recuo e o recuo, resultando em células seguem frequentemente a previsão do modelo Hertz. Módulos de Young de células pode ser calculada a partir das curvas de força de recuo, equipando-os com o modelo Hertz. Este método tem sido amplamente utilizado para testar as propriedades mecânicas do tecido, e as células, apesar de as suas limitações, tais como a incerteza na determinação do ponto de contacto, a aplicabilidade do modelo de Hertz, e o potencial para danificar fisicamente as células. Entre os muitos dispositivos para microindentaion ^20, o Microscópio de Força Atômica (AFM) está disponível comercialmente e tem sido amplamente aplicada para caracterizar as propriedades mecânicas das células vivas e tecidos ^21,24-27.

Este trabalho demonstra o procedimento de usar um Asylum MFP3D-Bio AFM para caracterizar mecânica celulares. AFM não emly fornece topografia de alta resolução das células, mas também tem sido amplamente aplicada para caracterizar as propriedades mecânicas das células dos tecidos. O princípio da AFM recuo é ilustrada na Figura 1. O braço de suporte de AFM se aproxima da pilha de alguns micrómetros acima; faz contacto com a célula, travessões, a célula de modo que a deformação do cantilever atinge um ponto de ajuste pré-seleccionado, e puxa para fora da célula. Durante este processo, a deformação do cantilever é registada como uma função da sua posição, como mostrado na Figura 1. Antes de fazer o contacto com a célula, o cantilever se move no meio sem qualquer deflexão aparente. Quando recuo sobre a célula, as curvas em cantilever e os aumentos de sinal de deflexão. As vigas são modeladas como vigas elásticas, de modo que a sua deformação é proporcional à força aplicada à célula. Ao definir a deflexão máxima cantiléver, a magnitude da força máxima aplicada à amostra é limitado para evitar dAmage às células. A parte da curva de força a partir do ponto b ao ponto C na Figura 1, onde os travessões da ponta para dentro da célula, está apto para o modelo hertz para extrair a rigidez da célula.

Figura 1. Ilustração da AFM microindentação e interpretação da curva de força. O painel superior mostra o movimento de AFM cantilever impulsionado pelo scanner piezo. A localização vertical do braço de suporte e o braço de suporte z deflexão d sinal é registado durante o processo. O braço de suporte começa a partir de um ponto, alguns micrómetros acima da célula. Ao aproximarem-se da célula, o recuo δ amostra permanece zero até atingir o ponto b, onde a ponta entra em contacto com a célula. As coordenadas do ponto b no gráfico são os valores críticospara a análise de dados, indicado por (z _0, d _0>). De b para c, os travessões cantilever na célula até que a deflexão do cantilever atinge um ponto de ajuste, que é definido como sendo a relação entre a força de recuo máximo alvo ea constante da mola cantilever. Uma vez que o sinal de deflexão atinge o valor máximo pré-definido, o cantilever é então retirado a partir da célula até ao ponto d, em que, muitas vezes, ser puxado para baixo devido à adesão de ponta-amostra, destaca a partir da célula e retorna à sua posição inicial em E. O painel da direita mostra a relação entre a reentrância e o sinal gravado e z d. Em no painel inferior esquerdo é um gráfico de uma curva representativa de força, o recuo máximo de um braço de suporte, das quais a constante de mola é medido para ser 0.07N / m, é ajustado para ser de 17 nm, de modo que a máxima força de recuo aplicada ao amostra é de 1,2 nN. Os locais-chave durante o recuo são marcadas.

Protocolo

1. Calibrar a constante da mola do cantilever

1. Carregar o cantilever na AFM de acordo com as instruções do fabricante. É necessário limpar o titular do cantilever com etanol antes de todas as experiências. Isto irá ajudar a limitar a contaminação da cultura bacteriana durante as medidas de AFM.
2. Calibrar InvOLS (sensibilidade Lever Optical Inverse). Este parâmetro descreve a quantidade de resposta do fotodiodo (Volts) por nanómetro de deflexão do cantilever.
3. Coloque uma lâmina de vidro limpa para o estágio da amostra, em seguida, instala na cabeça AFM e ajustar o alinhamento do feixe de laser e de acordo com as instruções do fabricante. Envolver a ponta do AFM sobre a lâmina de vidro.
4. Com o piezo retirado, realinhar o espelho para uma leitura fotodiodo de -2 V. realizar uma medição de espectroscopia de força com um ponto de disparo (resposta máxima fotodiodo) de 2 V.
5. Com o piezo retirado, realinhar o espelho para uma leitura fotodiodo de -2 V. Realizar uma force medição espectroscopia com um ponto de disparo (resposta máxima fotodiodo) de 2 V. Nota: Os valores de tensão aqui são específicas para o Asilo AFM. Esse valor deve ser definido de acordo com as especificações fornecidas pelo fabricante.
   Após a aquisição de dados está completa, o zoom para a região de contacto de firme a curva da força. Realizar um ajuste linear a esta região para encontrar o declive, o que irá estar em V / nm. O valor recíproco da presente descreve a sensibilidade óptica do conjunto cantilever fotodiodo.
6. Redefinir o alinhamento espelho para uma deflexão livre de 0 V.
7. Calibrar a mola cantilever constante. Um método térmico de sintonia é usado para determinar a constante de mola cantilever ^28.
8. Após calibragem dos InvOLS, aumentar o scanner afastada da fase da amostra de tal modo que não há interacções entre a ponta ea amostra.
9. Começar a capturar dados térmicos. Durante este processo, a vibração térmica do cantilever é Recorded. O software AFM analisa um espectro de uma vibração e parcelas em uma janela de dados térmica tal poder.
10. Depois de alguns segundos de aquisição de dados, executar um ajuste para o segmento de dados centralizada ao menor frequência (ressonância fundamental), pico de determinar a constante da mola.

2. Carregando o Sample

1. Instale o acessório aquecedor Dish no palco AFM, se já não estiver equipada.
2. Ajustar a temperatura para 37 ° C, e esperar, durante 20 minutos para que o sistema atinja um equilíbrio térmico estável.
3. Colocar a placa de cultura na fase de AFM e fixá-lo usando a braçadeira fornecida com o aquecedor de prato. É importante minimizar o tempo entre a remoção do prato da incubadora e colocando-o sobre o palco, para evitar o trauma para as células. Para medições mais longos do que 30 minutos, ₂ médias independentes CO deveria ser utilizada para substituir o meio de cultura normal.
4. Aplicar uma pequena gota de 37 ° C, meio de cultura para a ponta de tele AFM cantilever, e baixar a cabeça até a ponta do AFM é apenas submerso no líquido.
5. Utilizando a câmara superior com vista CCD, realinhar o feixe de laser sobre o braço de suporte (o alinhamento no estado líquido irá ser diferente do que no ar, devido à alteração no índice de refracção do meio).
6. Envolver a ponta do AFM em uma área limpa da placa de cultura.
7. Executar a calibragem dos InvOLS como acima descrito, para a sensibilidade do cantilever no meio líquido.

Nota: a) Se as células são cultivadas em hidrogéis, a calibração de InvOLS devem ser realizados em avanço contra a superfície de fundo de um prato de cultura cheio com meio de cultura celular. Ao mudar para amostras de células, uma atenção especial deve ser dada para não mudar o alinhamento do feixe de laser com o cantilever. b) InvOLS tem de ser recalibrada sempre que houver uma alteração no alinhamento do laser. c) Recomenda-se também a tomar InvOLS como a média de valor de várias curvas de calibração, sesde a cada calibração que gera um diferente InvOLS. A variação no InvOLS é, contudo, pequena em comparação com o valor médio. Por exemplo, calibrar um Bruker DNP-10 cantilever com constante de 0,06 N / m em líquido por 100 vezes primavera produzir um valor médio InvOLS de 66,3 nm / V, com desvio padrão de apenas 0,5 nm / V.

3. Coleta de curvas força de recuo celular

1. Selecione uma célula para recuo. Com o auxílio do microscópio óptico, a fase de mover a posição do braço de suporte acima da pilha de modo que a ponta está situada na região peri-núcleos. Ajuste preciso da posição do braço de suporte pode ser conseguida através da aplicação de deslocamentos para o X e Y scanners.
   Nota: O cantilever AFM tem de ser retirado da superfície da amostra, enquanto se deslocam a fase de amostra para seleccionar uma célula alvo. Isso protege o cantilever de bater na amostra, uma vez que a superfície da amostra não pode ser plana.
2. Mudar para forçar o modo de Espectroscopia. Definir o recuotaxa dentro da gama de 1-10 mM / seg, suficientemente baixa para evitar efeitos hidrodinâmicos.
3. Definir o ponto de disparo de deflexão, que limita a força de recuo máximo para evitar danos para as células. Seleccione a opção de disparo relativo, que irá corrigir qualquer desvio no sinal de deflexão. A força máxima de 2 nn é um bom ponto de partida para a maioria das amostras. Este valor, no entanto, devem ser ajustados de acordo com a rigidez da amostra. Para as amostras macias um valor mais baixo deve ser usado para evitar o recuo excessivo para a amostra. Para amostras rígidas um valor alto deve ser usado para gerar recuo mensurável.
4. Definir a distância força suficientemente grande para garantir que a ponta estará completamente separada da célula entre as medições de força. Geralmente, a distância força é fixado em 5 um.
5. Comandar o AFM para tomar uma curva de força única.
6. Recolher pelo menos três curvas de força em diferentes locais na região peri-núcleo de cada célula. Embora seja vantajoso ter múltiplascurvas em cada célula de dados estatísticos fiáveis, tendo muitas curvas de força pode levar a mudanças na rigidez da célula devido ao estresse da sonda AFM.
7. Quando a coleta de dados estiver concluída, retire a ponta, e repita os passos de 3,1-3,6 para o maior número de células, conforme necessário para bons dados estatísticos sobre a rigidez da célula sob uma determinada condição de amostra. Normalmente, as células 30 são medidos para cada condição.

Para caracterizar a distribuição de rigidez dentro de uma única célula, o modo de mapa de força é aplicada. No modo Force-mapa, definir um tamanho de digitalização para incluir a região de interesse, definir uma resolução adequada, definir os parâmetros de recuo como os selecionados para as curvas de força única, o AFM será então raster em toda a área da amostra definida e ter curvas única força em cada pixel na região da amostra.

4. Análise de Dados

As curvas de força registados são analisados ​​utilizando um procedimento MATLAB personalizado para calcular a rigidez da célula. A seguir, uma breve descrição do procedimento MATLAB:

1. O programa Matlab identifica o ponto de contacto coordenadas z0 e d0 (ver figura 1), utilizando um algoritmo adoptada a partir de um método publicado por Lin et al ^29.:
2. Para cada ponto de dados da curva de força, realizar um ajustamento linear dos dados para a esquerda do ponto de interesse, e um modelo de Hertz apto para a direita (com o ponto seleccionado como o ponto de contacto inicial), até o conjunto recuo máximo (200-300 nm recomendado).
3. Para cada ponto, calcular o erro RMS relativa de ambas as convulsões e somar esses valores.
4. O ponto que atinge o erro total mínimo adequado é selecionado como o ponto inicial de contato.
   Nota: O tempo de cálculo pode ser reduzida através da aplicação de uma pesquisa de secção dourada, em vez de digitalização linear da curva de força inteira.
5. Amostra δ deformação e recuo força F é calculado como:
   
6. Um quadrados de montagem é aplicada a pelo menos encaixar a F vs δ dados na região pós-contacto, z ≥ z _0, para o modelo de Hertz para extrair o módulo de Young, E da célula:
   
   , Onde v é o coeficiente de Poisson.
   Nota: Quando δ é mais do que 10% da espessura da amostra (altura da célula), a rigidez da célula medida é afectada pela rigidez do substrato. A espessura da região peri-nuclear é geralmente na ordem de alguns micrómetros. Portanto, somente os primeiros 200-300 nm de F-δ curva está apto para o modelo de Hertz.

Resultados

A Figura 2a mostra três curvas representativas força tomadas a partir de fibroblastos 3T3 cultivadas na superfície de plástico, em gel de poliacrilamida de módulos de Young 3000 Pa e 17.000 Pa, respectivamente. Depois de identificar cuidadosamente os pontos de contacto nas curvas, a força de recuo em função da deformação celular está representada na Figura 2b. Sob uma força de magnitude menor do que 0,3 nN, uma pirâmide de forma da ponta travessões 3 micrômetros em uma célula cultivadas...

Discussão

O método de recuo AFM tem vantagens para caracterizar as propriedades mecânicas de células vivas. Embora menos sensível do que a citometria de torção magnética e pinças ópticas, que pode medir forças no nível piconewton ^32, o AFM pode detectar a força de resistência de amostras variando de dezenas de pico-Newton para centenas de nano-Newton, comparáveis ​​a gama de força que pode ser aplicado a células utilizando uma micropipeta ^19. Esta gama de força se adapta às necessidades de criar deformações ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio de Força Atômica	Asylum Research	MFP3D-BIO