Summary
Menneskelige tumorxenotransplantater i immunodeficient mus er verdifulle verktøy for å studere kreft biologi. Spesifikke protokoller for å generere subkutane og intrahepatiske xenografts fra humane leverkreft celler eller tumor fragmenter er beskrevet. Leveren regenerering indusert ved delvis hepatectomy i mottaker mus er presentert som en strategi for å lette intrahepatisk engraftment.
Abstract
In vivo eksperimentelle modeller av leverkreft (HCC) som rekapitulere den menneskelige sykdommen gi en verdifull plattform for forskning på sykdom patofysiologi og for preklinisk vurdering av nye behandlingsformer. Vi presenterer en rekke metoder for å generere subkutan eller ortotopiske human HCC xenografts in immunodeficient mus som kan benyttes i en rekke forskningsapplikasjoner. Med et fokus på bruk av primærtumor vev fra pasienter som gjennomgår kirurgisk reseksjon som utgangspunkt, vi beskrive utarbeidelsen av cellesuspensjoner eller svulst fragmenter for xenografting. Vi beskriver spesifikke teknikker for å xenograft disse vev i) subkutant, eller ii) intrahepatically, enten ved direkte implantering av tumorceller eller fragmenter inn i leveren, eller indirekte ved injeksjon av celler i musemilt. Vi beskriver også bruk av delvis reseksjon av den opprinnelige muselever ved xenografting som en strategi for åindusere en tilstand av aktiv lever regenerering i mottakeren mus som kan lette intrahepatisk engraftment av primære humane tumorceller. De forventede resultatene av disse teknikkene er illustrert. Protokollene er beskrevet er godkjent for bruk primære menneskelige HCC prøver og xenografts, som vanligvis utfører mindre robust enn de veletablerte menneskelig HCC cellelinjer som er mye brukt og ofte sitert i litteraturen. I sammenligning med cellelinjer, diskuterer vi faktorer som kan bidra til relativt lav sjanse for primær HCC engraftment i xenotransplantasjon modeller og kommentere på tekniske problemer som kan påvirke kinetikken av xenograft vekst. Vi foreslår også metoder som å sikre at xenografts innhentet nøyaktig ligne foreldre HCC vev skal brukes.
Introduction
Leverkreft (HCC) er den femte vanligste kreftformen på verdensbasis, og den raskest økende årsaken til kreftdød i Nord-Amerika. Den mest utbredte risikofaktor for HCC er skrumplever, hyppigst forekommende på grunn av kronisk viral hepatitt, alkoholmisbruk, autoimmun sykdom, eller arvelige metabolske forstyrrelser en.
Til tross for den tunge sykdomsbelastningen pålagt av HCC på populasjoner over hele verden, er patofysiologien for HCC relativt dårlig forstått i forhold til andre vanlige kreftformer slik som kolorektal, bryst, eller prostatakreft. For eksempel, bestemte molekylære og cellulære hendelser kjøre tumorigenesis gjenstår å være klart definert to. Som de fleste andre faste epitelial kreft, har genomisk tilnærminger avslørt heterogenitet i de avvik forbundet med HCC tre. En rekke studier har vist uordnede aktiviteten av et utvalg av signalveier som er involvert i celle-proliferasjon, survival, differensiering, og angiogenese fire. I tillegg rollen som kreft stamceller i HCC patobiologi ennå ikke klarlagt 5.
Med en begrenset forståelse av HCC patofysiologi, har armamentarium av effektive behandlingsformer for HCC også holdt seg relativt begrenset. Tidlig stadium pasienter med svulster begrenset til leveren er kandidater for kurativ behandling ved hjelp av svulst ablasjon eller kirurgisk fjerning, men tilbakefall er vanlig. For pasienter med mer avansert sykdom, cellegift og stråling er av begrenset effekt, og brukes primært for sykdomskontroll med palliativ hensikt seks.
Høy kvalitet in vivo forsøksmodeller av human HCC gir således en verdifull plattform for mye nødvendig grunnforskning i patofysiologien for human HCC samt for evaluering av nye terapeutiske tilnærminger. Som sammenlignet med bruk av cellelinjer eller høyt definerte musemodeller, xenografter av primary menneskelige svulster i immundefekte mus har dukket opp som verdifulle verktøy for slike studier siden de er i stand til å rekapitulere den menneskelige sykdom med high fidelity og samtidig ta den heterogeniteten som er til stede i og mellom ulike pasienter 7,8. For å oppnå dette, har vi utviklet en rekke metoder for å etablere menneskelige HCC xenografts i immunsvikt mus. Mens de fleste publiserte studier med HCC xenografts beskrive bruk av veletablerte menneskelig HCC cellelinjer for dette formålet, har vi fokusert på å optimalisere våre analyser for å generere xenografts fra primær HCC prøver hentet umiddelbart etter kirurgisk reseksjon fra pasienter.
Ulike xenografting teknikker kan være nødvendig for ulike forskningssøknader. For eksempel er subkutane xenografts generert fra tumor fragmenter generert raskt, er lett overvåkes, og kan være mer hensiktsmessig for lokal forvaltning av romanen legemiddel med praktiskovervåking av tumorrespons. Intrahepatic xenografts kan være mer relevant for studier knyttet til rollen som den levermikromiljøet i HCC biologi. Xenografts generert fra tumorcellesuspensjoner er nødvendig for identifikasjon og karakterisering av tumor-celle undergrupper initiering eller for eksperimenter som krever in vitro manipuleringer av tumorceller før xenotransplantasjon. Vi har derfor utviklet og validert følgende protokoller for å etablere subkutan eller intrahepatic xenografts fra cellesuspensjoner eller svulst fragmenter avledet fra primær menneskelig HCC prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En skjematisk oversikt over den protokoll er presentert i figur 1..
En. Processing of Human HCC Samples
Skaffe primære menneskelige HCC prøvene med skriftlig pasientsamtykke og med godkjenning av den institusjonelle forskningsetisk bord. Disse protokollene har blitt utført ved vår institusjon med godkjenning fra University Health Network forskningsetikk Board i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd.
Samle ferske HCC prøver så snart som mulig etter den kirurgiske prosedyren en gang hensiktsmessige prøver har blitt tatt for kliniske formål. Ideelt bør dette skje i løpet av 30 min etter fjerning av vev fra pasienten. Som illustrert i figur 2, er en prøve på minst 1 cm 3 erholdt fra omkretsen av svulsten optimal, da det sentrale parti av tumoren kan bli nekrotisk.Svulster som ikke har mottatt noen behandling før reseksjon eksempel stråling, kjemoterapi eller ablasjon er foretrukket for å maksimalisere muligheten for at tumorcellene er levedyktige. Håndtak primære humane vev i henhold til standard personlige beskyttelses protokoller for biologisk materiale. Utføre alle laboratorie manipulasjoner av tumor vev og cellepreparater i en klasse II biosikkerhet kabinett med aseptiske teknikker.
- Plasser den friske HCC prøven i 10 til 25 ml serum-fritt Dulbeccos Modified Eagle Medium / Ham 's F12 ved 4 ° C, og overfører på is til laboratoriet for umiddelbar bearbeiding og fremstilling av vevs-fragmenter og / eller celler for xenografting i mus.
- Ved hjelp av sterile pinsetter, plasserer tumorprøve i en 100 mm x 20 mm petriskål eller annen egnet steril arbeidsflate. Fordel svulsten prøven i fragmenter av ca 2-3 mm 3 ved hjelp av en No.10 kirurgisk skalpell blad. På dette punktet, bør du vurdere snap-frysing eller formalin fiksing some tumorfragmenter for andre eksperimenter eller analyser som kreves.
- For xenografting av tumorfragmenter, plassere noen av HCC-fragmenter inn i en eller flere av mikrosentrifugerør inneholdende nok Matrigel å tillate fragmentene for å forbli neddykket. Hold disse rørene på is.
- For fremstilling av en tumorcellesuspensjon, bruk kirurgisk skalpell blad å hakke den gjenværende HCC vev så mye som mulig, og blandes med 5-10 ml av DMEM-F12 i et 50 ml konisk rør, avhengig av volumet av hakket vev.
- Legg kollagenase type IV og dispase II til sluttkonsentrasjoner på 200 enheter / ml og 0,8 enheter / ml henholdsvis. Pipetter blandingen opp og ned brønnen ved hjelp av en 25 ml pipette.
- Forsegl røret og inkubere blandingen fra trinn 1.6 ved 37 ° C i en 5% karbondioksyd-inkubator i 30-60 minutter avhengig av mykheten av tumorvevet. Pipetter blandingen opp og ned et par ganger hvert 10 min for å vurdere fremdriften av den enzymatiske fordøyelsen.
- Etter digestion er fullført, passerer tumor-løsning gjennom en 100 mikrometer celle sil. Forsiktig mos den gjenværende vev på celle sil ved hjelp av en 25 ml pipette for å muliggjøre maksimalt antall av tumorceller til å passere gjennom. Samle den anstrengte cellesuspensjonen i en 15 ml konisk tube.
- Sentrifuger tumorcellesuspensjonen ved 1200 rpm i 5 min ved 4 ° C.
- Forsiktig dekanter supernatanten. Avhengig av størrelsen av pelleten, tilsett 2-5 ml iskald 1x røde blodcelle (RBC) lysebuffer og forsiktig pipettere opp og ned for å resuspendere pelleten. Hold på is i 5 min.
- Til DMEM-F12 til et totalt volum på 15 ml og sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min ved 4 ° C for å vaske ut RBC lysis buffer.
- Forsiktig dekanter supernatanten og resuspender RBC-fri tumor cellepelleten i DMEM-F12.
- Antall levedyktige celler ved hjelp av trypanblått-eksklusjon, enten manuelt eller med en automatisk celleteller.
- Sentrifuger tumorcelle alikvoter inneholdende det ønskede number av celler for injeksjon som beskrevet ovenfor, resuspender den resulterende cellepelleten i 30 pl av iskald Matrigel, og lagrer på is.
Valgfritt: Etter trinn 1.11, vi rutinemessig utarme menneske CD45 + celler (leukocytter) fra bulk svulst celle suspensjon og / eller rense undergrupper av kreftceller ved hjelp av flowcytometri eller immunomagnetiske perler. Detaljerte protokoller for disse teknikkene er godt beskrevet av produsentene av de aktuelle antistoffer, perler og flowcytometere.
Merk: Protokollen som er beskrevet ovenfor kan også brukes til å behandle humane tumor xenografter høstet fra mus for å utføre serietransplantasjon, ved å erstatte den xenograft vevet for den primære human HCC vev i trinn 1.1. I denne situasjonen etter trinn 1.11, vi rutinemessig utarme infiltrerende murine celler fra cellesuspensjonen ved å bruke et antistoff mot mus histocompatibility antigenet H2k.
2.Xenografting
Gjennomføre alle dyre prosedyrer i samsvar med protokoller godkjent av institusjonelle dyr omsorg komiteen. Prosedyrene er beskrevet her har blitt gjennomført under en bestemt Animal Bruk protokoll godkjent av University Health Network Animal Care komité i samsvar og samsvar med alle relevante regulatoriske og institusjonelle etater, forskrifter og retningslinjer.
Utstyr for levering av inhalasjonsanestesi flyktige anestesimidler til små dyr bør utnyttes i henhold til standard operasjonsprosedyrer av dyret anlegget og forskningsinstitutt. Utføre alle kirurgiske prosedyrer ved hjelp av aseptisk teknikk og sterile instrumenter i en klasse II biosikkerhet skap. Utnytte ikke-overvektige diabetikere alvorlig kombinert immunsvikt (NOD / SCID) eller NOD / SCID / interleukin 2 reseptor gamma kjeden null (NSG) stammer av mus av begge kjønn ved 6-8 ukers alder (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Dissemus som skal plasseres og opprettholdes i et anlegg som kan gi patogen-frie betingelser som er egnet for dyr med immunologiske forstyrrelser.
Forbered mus for operasjon i et kammer å tilføre 5% (v / v) inhalert isofluran i 1 l / min oksygen. Oppretthold anestesi inntil det er tap av hornhinnerefleks og tå i dyret (e). For subkutan xenografting, barbering en eller flere små områder på fotens rygg på dyret (e) og rense huden med 70% etanol. For intrahepatisk xenografting, barbere ventral thorax og buk av dyret (s) fra axillae ned til lyske regionen og rense huden med 70% etanol.
2.1 Subkutan Implantasjon av Tumor Fragments
- Plasser bedøvet mus utsatt for, opprettholde inhalasjon isofluran anestesi (2% (v / v) i 1 l / min O 2) med et munnstykke. Påfør Tear-Gel å beskytte dyrets øyne fra traumatisk skade.
- Steril dorsal barberte området (er) med Betadinekirurgisk scrub etterfulgt av 70% etanol og til slutt med povidon-jodløsning.
- Lag en 5 mm snitt i huden ved hjelp av sterile skarp saks.
- Sett inn en lukket sløv saks forsiktig inn i subcutaneous plass og spre forsiktig å utvikle en lomme stor nok til å romme en svulst fragment.
- Sett svulsten fragment utarbeidet i trinn 1.3 i underhudsfettet lomme med sterile fin pinsett.
- Lukk huden innsnitt ved hjelp av sting eller klips.
- Gi postoperativ pleie til mus, som beskrevet nedenfor.
2,2 Subkutan injeksjon av tumorcellene
- Forbered dyret som beskrevet i trinn 2.1.1 og 2.1.2.
- Laste suspensjon av tumorceller i Matrigel fremstilt i trinn 1,13 til en insulinsprøyte med en 29 G 1/2 i nålen.
- Sett nålen inn i subcutaneous plass og utslipp innholdet i sprøyten. Advancing nålen flere millimeter langs subkutane planet unna frOM huden stikkstedet forhindrer lekkasje av svulst celle suspensjon ut av innstikkstedet ved uttak av nålen.
- Gi postoperativ pleie til mus, som beskrevet nedenfor.
2.3 Intrahepatisk Implantasjon av Tumor Fragments
- Ved å bruke en 27 G 1/2 i nålen på en 1 ml sprøyte, gi 350 mikroliter sterilt fysiologisk saltvann subkutant i dorsum av bedøvet dyrets hals for å kompensere for intraoperative væsketap. For analgesi, gi 350 mikroliter sterilt normalt saltvann inneholdende buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant på dyrets flanke, med en 27 G nål 1/2-in på en 1 ml sprøyte.
- Sett muse liggende på en forvarmet puten med nese og munn plasseres inne i munnstykket for å gi vedlikeholds inhalasjon isofluran anestesi (2% (v / v) i 1 l / min O 2).
- Utvid bena og fest dem med tape til drifts overflaten for å optimalisere eksponeringen avventrale abdomen og thorax.
- Utfør prosedyren under et forstørrelseslampe for å optimalisere visualisering.
- Sterilisere barbert hud på ventral abdomen og thorax med Betadine kirurgisk skrubb etterfulgt av 70% etanol og til slutt med povidonjodid løsning.
- Bruk sterile skarp saks, lage en tverrgående bilateral subcostal hud innsnitt og dele muskellagene til å gå inn i bukhulen for å tillate tilstrekkelig eksponering av hele leveren.
- Plasser et sting i huden over xiphoid prosessen og fest den til munnstykket med tape for å gi bedre eksponering av leveren og omkringliggende strukturer.
- Bruk to bomull-tipped applikator tilstøtende og posterior til leveren for å stabilisere den.
- Lag et innsnitt 3 mm i lengde og dybde på overflaten av leveren ved hjelp av en steril nr 10 skalpellblad.
- Umiddelbart gjelder Surgicel og milde press til innsnitt området for å oppnå hemostase; fjerne etter 60-90 sekog fortsette bare hvis fullstendig hemostase er oppnådd.
- Plasser en tumor fragment trinn 1.3 inn i leveren innsnitt med sterile fin pinsett eller med en 18 G nål.
- Påfør en liten del av Surgicel over leveren innsnitt for å hindre forskyvning av tumor-fragment og sikre kontinuerlig hemostase.
- Lukk snittet med sting eller klips.
- Gi postoperativ behandling som beskrevet nedenfor
2,4 Intrahepatisk Implantasjon av tumorceller via Direct Injection inn i leveren
- Forbered musen som beskrevet i trinn 2.3.1 til 2.3.7 ovenfor.
- Laste tumorcellesuspensjon (fremstilt i trinn 1.13) i en insulinsprøyte ved hjelp av en 29 g 1/2 i nålen.
- Med leveren stabilisert ved hjelp av en bomulls-tip applikator, setter insulin sprøytespissen inn i leveren og fremme tips noen få millimeter utenfor stikkestedet langs en subcapsular flyet.
- Forsiktig tømmes innholdet i sprøyten og thøne fjerne nålen fra leveren.
- Plasser Surgicel over stikkstedet og trykk forsiktig med en bomullstupp applikator for å forhindre lekkasje av svulsten cellesuspensjonen og å oppnå fullstendig hemostase.
- Lukk snittet med sting eller klips og gi postoperativ omsorg som beskrevet nedenfor.
2,5 Intrahepatisk Xenografting av tumorceller via Injeksjon i Spleen
- Forbered musen som beskrevet i trinn 2.3.1 til 2.3.5 ovenfor.
- Bruk sterile skarp saks, gjør en en cm igjen subcostal snitt for å komme inn i bukhulen.
- Bruk av en bomullstupp applikator for å reflektere magen kranialt og mot dyrets høyre side for å avdekke milten.
- Ved å håndtere de omkringliggende fettvev med sterile fin atraumatiske tang, levere milten i snittet og plassere en bomull-tipped applikator bak milten for å stabilisere den.
- Bruke 5-0 silke sutur, steden løs pre-bundet knute rundt milten over den nedre stang.
- Laste tumorcellesuspensjon (fremstilt i trinn 1.13) i en insulinsprøyte ved hjelp av en 29 G 1/2 i nålen.
- Sett insulin sprøytespissen i den nedre pol av milten og føre den frem forbi nivået av den løse pre-bundet knute.
- Sakte ut innholdet i sprøyten, trekk ut nålen fra milten, og stram knute for å forhindre lekkasje av injisert svulst celle suspensjon.
- Sett milten inn i bukhulen.
- Lukk snittet med sting eller klips og gi postoperativ omsorg som beskrevet nedenfor.
2,6 Partial hepatectomy til rette Intrahepatisk engraftment of Human svulstvev
- Forbered musen som beskrevet i trinn 2.3.1 til 2.3.7.
- Med sterile skarp saks, dele falciform ligament er festet til medianleverlapp.
- Ved hjelp av en bomull-tipped applikator, mobiliserevenstre lapp i leveren og posisjon en løs pre-bundet knute av 5-0 silke sutur rundt venstre lapp. Fremme løs knute så nær som mulig mot bilio-vaskulær pedicle av venstre lapp og stramme knuten.
- Avgiftsdirektoratet venstre lapp distal til ligaturen ved hjelp av steril saks, og etterlater en liten stubbe for å forhindre glidning av knuten og påfølgende blødning.
- Ved hjelp av en lignende teknikk, og å ligere resect flertallet av median flik av leveren, unngå galleblæren.
- Bruk Surgicel og milde press med en bomull-tipped applikator langs kantene på leverparenkym å oppnå fullstendig hemostase.
- For intrahepatisk xenografting av et tumorfragment eller tumorceller, fortsett med trinn 2.3.8 til 2.3.11 eller 2.4.2 til 2.4.5 som beskrevet ovenfor.
- For intrahepatisk xenografting av tumorceller via milt injeksjon, utnytte bomull-tipped applikator å forsiktig reflektere magen kranialt og til dyrets høyre side, exposing milten. Fortsett med trinn 2.5.4 til 2.5.9 som beskrevet ovenfor.
- Lukk snittet med sting eller klips og gi postoperativ omsorg som beskrevet nedenfor.
2.7 Postoperativ Care
- Fjern musen fra inhalasjonsanestesi munnstykket.
- Plasser musen i et bur under en varmelampe for ca 20 min før bedring fra anestesi og mobiliserer fullt.
- Gjenta buprenorfindosen hver 8-12 timer i løpet av de første 2-3 postoperative dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser det typiske utseende av en subkutan human HCC xenograft og den tilsvarende histopatologisk utseende av tumoren. Utvikling og vekst av subkutane xenografts lett kan overvåkes ved daglig undersøkelse av mottaker mus. Tidsintervallet mellom xenografting og utvikling av en tumor, kan variere sterkt avhengig av typen vev (tumor-fragment sammenlignet med cellesuspensjonen), en kilde for vev (primær pasientprøve, passaged xenotransplantat, eller cellelinje), og mengden av vev implanteres ( antall celler eller størrelsen av tumor-fragment). For eksempel kan betydelige xenografts utvikles fra injeksjon av 5 x 10 6 celler av en etablert cellelinje HCC i løpet av 1-2 uker, mens 6 måneder kan være nødvendig for utvikling av en lignende xenograft fra 1 x 10 5 celler fremstilt fra en primær pasient HCC prøven. Vi har ikke observert subkutan xenograft dannelse senere enn seks måneder etter implantation av svulsten prøven, og dermed ofre mottaker-mus ved dette endepunktet dersom xenografts ikke utviklet.
Fig. 4 viser de typiske opptredener av intrahepatiske human HCC xenografts oppnådd direkte implantering av tumorvevet inn i leveren, så vel de som ble oppnådd ved injeksjon av tumorceller inn i milten. Intrahepatisk xenografts kan ikke lett oppdages ved generell fysisk undersøkelse av mottakeren mus med mindre tumor er meget stor eller har resultert i utvikling av ascites eller abdominal distensjon. Selv små dyr bildediagnostikk som CT-skanning er tilgjengelig på enkelte forskningsinstitutter og kunne brukes til nøyaktig avhøre leveren til mottaker mus 11, anser vi ikke dette et allment gjeldende, praktisk, eller kostnadseffektiv tilnærming for de fleste etterforskere. Vi har observert at hastigheten som intrahepatiske xenografts utvikles er lik den hastighet ved hvilken subcutaneooss xenografter utvikles, og er på lignende måte berørt av variabler som typen, kilden, og antallet av vev implanteres. Basert på resultatene av subkutane xenografts avledet fra den samme overordnede vev som ved intrahepatic xenografts, velger vi en endepunktet for ofring til mottakeren mus og undersøkelse av leveren med mindre klare bevis for en stor intrahepatisk svulst er til stede før dette. Vi har observert at tilsetning av en partiell hepatektomi til intrahepatisk xenografting prosedyren brukes forbedrer sannsynligheten for å oppnå engraftment av humant tumorvev på muselever, men ser ikke ut til å akselerere hastigheten av xenograft vekst.
Tabell 1 oppsummerer svulst engraftment priser oppnådd etter implantasjon av primær menneskelig HCC vev i immundefekte mus ved hjelp av ulike teknikker som er beskrevet i denne protokollen. For hver implantering metoden, nevneren av svulsten avgangshastighet reflekterer en unik hum en HCC prøven. Disse dataene viser at for primær menneskelig HCC vev, subkutane engraftment priser er dårligere enn satsene for intrahepatisk engraftment oppnådd av intrasplenic svulst celle injeksjon eller intrahepatisk svulst fragment implantasjon, og at delvis hepatectomy ser ut til å forbedre intrahepatisk engraftment. Selv om vi har med hell benyttet direkte celle injeksjon i muselever for å generere intrahepatiske xenografter av godt etablerte humane HCC-cellelinjer (data ikke vist), har vi ikke generert noen intrahepatiske xenografter med denne metoden ved hjelp av primære humane HCC prøvene til tross for bruk av partiell hepatektomi .
Figur 1. Skjematisk oversikt over protokoll illustrerer arbeidsflyt for behandling og tilberedning av HCC prøven samt påfølgende xenografting alternativer (innfelt).
544fig2.jpg "/>
Figur 2. Leverreseksjon eksemplar fra en pasient med leverkreft. Denne pasienten hadde ikke mottatt noen adjuvant behandling til svulsten. Den hvite boks indikerer en levedyktig del av tumoren i nærheten av periferien, som ble oppnådd for xenografting. Målestokk øverst til høyre tilsvarer 1 cm.
Figur 3. Humant leverkreft xenograft generert fra subkutan injeksjon av tumorceller. A) Tumor kan lett forstås på høyre flanke av dyret. B) Tumor er sett å være forskjellig fra de omgivende vev etter at det går på bekostning dyret. C) Den histologi av svulsten viser typiske trekk ved leverkreft, inkludert hepatocytter-lignende celler med atom atypi og høy kjernefysisk-til-cytoplasmatisk ratio, fravær av portal traktater, og distorted trabeculae med økt tykkelse av hepatocellulære plater. Scale bar tilsvarer 1 cm i paneler A og B, og 100 mikrometer i panel C. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Intrahepatisk humane leverkreft xenografts. A) Xenograft genereres fra implantasjon av en human tumor-fragment i muselever. Intraparenchymal svulst angitt med svart pil. Omfanget av linjal nederst på fotografiet i cm. B) Xenograft generert fra injeksjon av humane tumorceller i mus milt følgende delvis hepatectomy. Intraparenchymal svulst angitt med svart pil. Scale bar tilsvarer 1 cm. C) Histologi snitt gjennom margin på intrahepatisk xenograft demonstrating typiske trekk ved menneskelig leverkreft (nederst til høyre) og tilstøtende normal mus leveren (øverst til venstre). Scale bar tilsvarer 100 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
| Implantasjon Side | Implantasjon Metode | Tumor Take Rate |
| subkutan | cellesuspensjon | 6/55 (10,9%) |
| tumor-fragment | 23/136 (16,9%) | |
| milt | cellesuspensjon | 3/15 (20%) * |
| celle suspensjon + delvis hepatectomy | 6/14 (42,9%) * | |
| leveren | tumor-fragment | 6/13 (46,2%) |
| tumor fragment + delvis hepatectomy 2/3 (66.7%) | ||
| cellesuspensjon | ikke utført | |
| celle suspensjon + delvis hepatectomy | 0/8 (0%) | |
| * Andelen av prøver som ga intrahepatiske tumor knuter | ||
Tabell 1. Menneske HCC engraftment priser i immundefekte mus som svarer til ulike implantasjonsteknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrevet en rekke teknikker for å etablere subkutan og intrahepatiske human HCC xenografts in immunodeficient mus som kan anvendes på et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål og-analyser. Mens subkutane xenografts har blitt mye brukt for å studere forskjellige aspekter av HCC biologi, er intrahepatiske xenografts sjelden er beskrevet i litteraturen. Videre har de fleste studier som beskriver bruken av xenografter ble generert fra disse etablerte cellelinjer. Gitt begrensningene i kreftcellelinjer i modellering menneskelig tumorbiologi 12, har vi blitt motivert til å validere de teknikkene som er beskrevet ovenfor med primær menneskelig HCC vev. Selv om det ikke støttes av statistisk analyse på grunn av de små utvalgsstørrelser av de eksperimentelle grupper, våre observasjoner subjektivt avslører en overbevisende trend mot bedre engraftment priser med tillegg av delvis hepatectomy til intrahepatisk implantasjon av kreftceller eller fragmenter. </ P>
De få studier som har strengt forsøkt å benytte primære vev oppnådd vellykkede subkutan engraftment med bare en svært liten andel av pasientprøvene oppnådd 13-15. Vi har også observert at andelen av primære humane HCC prøver som med hell engraft i det subkutane plass av immundefekte mus ved hjelp av de teknikker som er beskrevet ovenfor, er begrenset til ca 15%. I den menneskelige leveren, HCC lesjoner er hypervascular, mottar sin blodforsyning hovedsakelig via leverpulsåren 16,17. Vi spekulerer i at den lave engraftment frekvensen av primære HCC vev som vi og andre har observert, kan være et resultat av sårbarheten av fersk HCC vev til den relative hypoksi i mikromiljøet i hvilket de er xenografted, uten etablert arteriell tilførsel. Mottakelighet av HCC vev til rask iskemisk nekrose i intervallet mellom kirurgisk reseksjon og xenografting kan også account for den lave engraftment hastighet oppnås i mus.
For den generasjonen av intrahepatiske menneskelig HCC xenografts fra tumorcellesuspensjoner, har vi funnet at injeksjon av celler i milten er en teknisk gunstig tilnærming som resulterer i overlegen forekomst av lever engraftment fra primær menneskelige HCC prøver. Milten er en svært vaskualisert struktur som kan bedre støtte HCC celler sammenlignet med andre steder i musekroppen, og fra hvilke kreftceller ser ut til å lett reise inn i leveren via spleniske og portal årer. I sammenligning med leverparenkym, i hvilket det er teknisk vanskelig å direkte injisere cellene uten lekkasje eller blødning, har milten den strukturelle kapasitet til å romme volumet av cellesuspensjon som blir injisert, og kan enkelt ligert når tumorcelleinjeksjon er fullført. Injeksjon av cellesuspensjoner direkte inn i portvenen eller leverpulsåren i 6-8 uker gamle mus er ikke teknisk feasusynlige.
Vi har benyttet delvis hepatectomy i mottaker mus til rette intrahepatisk engraftment av menneskelige HCC vev. Selv musemodeller av delvis hepatectomy har vært mye brukt for å studere biologien til leveren regenerering 18, er vi ikke kjent med rapporter som beskriver den i kombinasjon med intrahepatisk svulst xenotransplantasjon. Siden leveren regenerering skjer raskt i løpet av de første dagene etter partiell hepatektomi, vi spekulert i at betydelig forbedret ekspresjon av mitogene og angiogene stimuli innen leverparenkym vil bedre støtte engraftment og proliferasjon av sårbare humant tumorvev eller-celler implantert i løpet av den gjenværende del av mus leveren, sammenlignet med en muselever i sin "hvile"-tilstand 19.. Hos mennesker er den største risikofaktoren for HCC utvikling avansert leverfibrose eller skrumplever, som er preget av utviklingen av uorganisert regenerativ neilette moduler, og som har blitt definert av noen som en tilstand av kronisk leverskade og regenerering 20. Teknikkene som vi har vist til engraft menneskelige HCC vev inn i muselever ved å aktivere leveren regenerasjon kan vise seg å være en verdifull modell for å tillate etterforskning i rollen som levermikromiljøet og lever regenerative mekanismer i patofysiologien av HCC.
Selv om teknikkene som er beskrevet her er i stand til å generere høy-kvalitets primære human HCC xenografter i immundefekte mus, må undersøkere som vurderer anvendelsen av disse protokollene vurdere noen begrensninger i modellen. Først våre protokoller innlemme minimal forsinkelse mellom kirurgisk reseksjon av pasientens vev og påfølgende behandling i laboratoriet, men likevel oppnå høy engraftment priser har vært en utfordring, og dette tyder på at levedyktig gjennomføring av disse teknikkene krever nærhet av pasientens vev oppsamlingsstedet tillaboratorium, eller infrastruktur som kan minimere forsinkelser i overføring av ferske prøver. For det andre må kompliserte intraabdominal kirurgiske prosedyrer på 6-8 uker gamle immundefekte mus utføres av trenet personell for å oppnå overlevelse av dyrene i flere måneder før xenografts dannes, og disse fremgangsmåter og etterfølgende dyr vare er både tid-og ressurskrevende. For det tredje, utvikling og progresjon av intrahepatiske xenografts kan ikke lett kontrolleres uten å ofre dyr ved forutbestemte tidspunkter, noe som begrenser nytten av xenografter i denne posisjonen for noen typer analyser som beskrevet ovenfor. I tillegg kan intrahepatiske xenografts avledet fra injeksjon av celler i milten frem som flere knuter spredt utover leverparenkym som er vanskelig å tallfeste nøyaktig i forhold til total tumorbyrde. Endelig er det viktig å merke seg at intrahepatiske tumor knuter som følge av injeksjon av celler i milten kan velgeively reflektere spesifikke subpopulasjoner av celler som er i stand til migrasjon fra milten til leveren og påfølgende startfasen.
Når du genererer xenografts fra primær menneskelig HCC vev, er det også viktig å få bekreftet at de resulterende xenografts likne HCC. Vi har tidligere vist at lymfomer kan utilsiktet utvikles fra passasjer leukocytter innenfor xenotransplanted menneskelig HCC vev 21. Dermed har vi rutinemessig utarme menneske CD45 + leukocytter fra primærtumorcellesuspensjoner og utnytte RT-PCR, flowcytometri, histopatologisk vurdering, og immunhistokjemi til analysen xenografts for egenskaper som er typiske for HCC. Når passering etablerte xenografts for videre studier, bør tumor-infiltrere murine celler også bli tømt ved hjelp av et antistoff mot mus histocompatibility antigen H2k. Hvis forskningen anvendelse involverer bruk av tumorfragmenter eller måling av xenograft vekst, analyse av xenografts ved studieslutt bør inkludere en vurdering av i hvilken grad de svulster er infiltrert av humane leukocytter og museceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en kanadiske Institutes of Health Research Fase 1 Lege-Scientist Award (AG) og en driftsstøtte fra Cancer Research Society (AG). Forfatterne er takknemlige til Dr. John Dick for sin støtte til dette prosjektet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
