Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em&gt; In vivo</em

Resumo

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese em In vivo Contexto. Coloração por imunofluorescência de visualizar com precisão o plexo vascular é essencial para o sucesso destes tipos de estudos.

Resumo

A angiogénese é o processo complexo da nova formação de vasos sanguíneos definido pelo surgimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes. A angiogénese desempenha um papel importante não só no desenvolvimento normal dos órgãos e tecidos, mas também de muitas doenças em que a formação de vasos sanguíneos é desregulada, tal como o cancro, cegueira e doenças isquémicas. Na vida adulta, os vasos sanguíneos são geralmente de repouso para a angiogênese é um alvo importante para a novela desenvolvimento de drogas para tentar regular a formação de novos vasos especificamente na doença. A fim de entender melhor a angiogênese e desenvolver estratégias adequadas para regulamentá-la, os modelos são necessários que refletem com precisão as diferentes etapas biológicos que estão envolvidos. A retina do rato neonatal fornece um excelente modelo da angiogénese porque as artérias, veias e capilares desenvolver para formar um plexo vascular durante a primeira semana após o nascimento. Este modelo também tem a vantagem de ter um dois-disional estrutura (2D) fazendo análise directa em comparação com o complexo anatomia 3D de outras redes vasculares. Ao analisar o plexo vascular retiniano em diferentes momentos após o nascimento, é possível observar os diferentes estádios da angiogénese sob o microscópio. Este artigo demonstra um procedimento simples para analisar a vascularização da retina de um rato utilizando a coloração fluorescente com anticorpos específicos isolectin e vascular.

Introdução

A angiogénese é um processo de desenvolvimento complexo definida pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes e é regulada por vários caminhos de sinalização. A mais importante destas é a via de VEGF. VEGF é liberado por células isquêmicos e leva à abertura de angiogênico brotando nos vasos sanguíneos vizinhos. A principal célula endotelial vascular a partir de um novo rebento é uma célula "ponta", que produz filopodios que chegar em direcção à fonte de VEGF, e é seguida por proliferação de células endoteliais "stalk". Desta forma, as células endoteliais activadas migrar e proliferar no sentido de uma região avascular, onde formam novos tubos vasculares. A fim de estabilizar esses tubos para apoiar o fluxo sanguíneo, as células endoteliais, pericitos e interagir com as células musculares lisas, que rodeiam os vasos sanguíneos novos ^1. A angiogénese é essencial para a vascularização do embrião e os tecidos em crescimento. No entanto, também contribui para muitos patológicasdistúrbios cal, tais como câncer, enquanto os defeitos na angiogênese estão associados com doenças isquêmicas. O desenvolvimento de tratamentos eficazes para regular a angiogénese de drogas como um meio para o tratamento da doença é, portanto, de grande interesse. Por exemplo, os factores anti-angiogénicos eficaz irá reduzir o crescimento do cancro, enquanto pró-angiogénicos estratégias podem ser usadas para tratar a doença isquémica. Assim, os modelos de angiogénese é essencial para compreender melhor a regulação da formação de novos vasos e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para aumentar ou diminuir o crescimento vascular.

Um elemento fundamental da pesquisa angiogénese é a escolha de um modelo adequado vascular. Muitos modelos in vitro ter sido concebido para reproduzir os passos básicos da angiogénese, tais como migração de células endoteliais, proliferação e sobrevivência ^2,3. Um frequentemente utilizado no ensaio in vitro é a formação de uma rede ramificada de células endoteliais sobre uma matriz Matrigel, apesar de tele não é específico para células endoteliais, nem geralmente incorporam o apoio de pericitos ou de células musculares lisas. Avaliação ex vivo da angiogénese brotando do rato usando a cultura de órgãos, tais como o ensaio de corpo embrióides, o ensaio do anel aórtico e o ensaio metatarso fetal permite a análise da angiogénese de células endoteliais, no contexto de células de suporte adicionais. No entanto, as principais limitações destes ensaios incluem a falta de fluxo sanguíneo e a regressão dos vasos ao longo do tempo, dando uma janela limitada para análise. Portanto, para compreender a regulação da angiogénese, mais precisamente, em modelos in vivo são necessários, tais como os desenvolvidos em ratinhos usando esponjas implantadas subcutaneamente ou tampões matrigel, bem como o modelo de isquemia dos membros posteriores. No entanto, estes modelos são difíceis de analisar devido ao complexo de arquitectura em 3D do neovasos. Em contraste, o embrião do peixe-zebra demonstrou ser um excelente modelo para a visualização de angiogénese no conjunto⁴ organismo. No entanto, o rato é evolutivamente muito mais intimamente relacionada com a humana do peixe-zebra, tornando o rato um modelo preferido, em muitos casos. Consequentemente angiogénese da retina do rato pós-natal, representa um método bem caracterizado de escolha para a pesquisa da angiogênese. Ele não só proporciona um ambiente fisiológico, mas também um plexo vascular 2D que podem ser facilmente visualizada utilizando manchas fluorescentes adequadas. A arquitetura da rede de vasos, proliferação endotelial, surgimento, o recrutamento de células perivascular e remodelamento podem ser investigadas usando esta técnica.

Na retina de rato neonatal, o desenvolvimento dos vasos sanguíneos da retina ocorre na primeira semana de vida pós-natal. Ratos, ao contrário dos humanos, nascem cegos e as retinas só se tornam vascularizado após o nascimento. Vasos retinianos surgir a partir do centro da retina perto do nervo óptico no dia 0 pós-natal (P0), e por angiogénese desenvolver para formar um altamente organizard plexo vascular que atinge a periferia da retina de cerca de ⁵ P8. Os vasos sanguíneos em desenvolvimento de uma forma característica, com o plexo capilar progressivamente crescente para fora a partir do disco óptico para a periferia para gerar um padrão de alternância regular das artérias e veias, com uma rede capilar interveniente. A vasculatura retiniana fornece um modelo ideal para estudar angiogénese, porque os vasos pode ser facilmente identificado à medida que crescem no que é essencialmente um plano 2D, tornando-se assim relativamente fácil para examinar a vasculatura da retina em preparações plana de montagem ^5. Um método para isolar a retina do rato neonatal para análise de respostas de células endoteliais da ponta ao longo de várias horas ex vivo, foi avaliado ^6. Alternativamente, uma investigação mais detalhada de todo o sistema vascular da retina e marcadores vasculares associadas requer imunocoloração de amostras retina fixos em diferentes fases de desenvolvimento.

Aqui nós fornecemosUma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para a coloração de montagem todo o plexo vascular retiniana de murino, a partir da enucleação inicial de pós-natal do olho (ver também a ⁷⁾ por meio dos protocolos de coloração para imagiologia último sob o microscópio.

Protocolo

Todos os passos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

1. Enucleação e Fixação de pós-parto Olhos

1. Posicione o mouse sacrificados filhote de cachorro de lado, retire a pele que cobre o olho com uma tesoura.
2. Use uma tesoura e uma pinça para enuclear o olho.
3. Coloque tesoura abaixo do olho enucleado, cortar o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira para uma placa de 24 poços contendo 4% de paraformaldeído (PFA) confeccionados em 2x PBS à temperatura ambiente.
4. Permitir que cada olho para corrigir por 10 - 15 min, em seguida, transferir para o frio 2x PBS no gelo por 5 - 10 min. O melhor é escalonar enucleações e fixação posterior para garantir o grau de fixação é igual para cada olho.

2. Dissecção da Retinas Murino pós-parto

1. Transferência de olhos em uma placa de Petri contendo 2x PBS usando uma pipeta Pasteur de plástico que foi cortada para alargar o furo e colocar sob um Dissecting microscópio.
2. Retire toda a gordura ao redor dos olhos usando uma pinça e tesouras.
3. Pierce a borda da córnea com uma tesoura afiada e corte em torno da córnea e íris e descarte.
4. Insira fórceps entre retina ea esclera e remover a esclera tomando cuidado para não rasgar a retina. A camada coróide também pode ser removido, mas se houver um risco de danos na retina que ocorra durante este passo, a camada coróide, pode ser deixado em que não deve afectar significativamente a qualidade da imunocoloração.
5. Retire a lente eo humor vítreo usando uma pinça.
6. Remover os vasos hyaloids reunindo-os em conjunto no centro do olho com uma pinça fina e puxe rapidamente para longe do centro da retina (alternativamente recorte na base de vasos hialóide com uma tesoura fina).
7. Enxágüe a retina em forma de copo com PBS em uma placa de Petri limpa.
8. Adicione 4-5 incisões radiais que alcançam, aproximadamente, 2/3 do raio da retina utilizando mola Tesourasrs para criar uma forma de "pétala".
9. Desenhe off PBS usando uma pipeta Pasteur para achatar a retina e, em seguida, retire o excesso de PBS com um pequeno pedaço de papel absorvente.
10. Lentamente pipeta frio (-20 ° C) queda de metanol por queda sobre superfície de retina até totalmente coberto e, em seguida, inundação com metanol adicional. Isso vai ajudar a consertar as retinas e irá facilitar a permeabilização. As retinas ficará branco.
11. Transferir para um tubo de 2 ml usando uma pipeta de Pasteur de plástico que foi cortado para alargar o furo.
12. Deixe retina em metanol frio por pelo menos 20 min antes de prosseguir com imunomarcação. Dos anticorpos utilizados aqui, apenas VE-caderina não pode ser utilizado com sucesso em metanol retinas fixos. Neste caso retinas precisa avançar direto para a imunocoloração após a etapa 9.
13. Se necessário, as retinas podem ser armazenadas em metanol a -20 ° C durante vários meses antes da coloração.

3. Immuno / coloração isolectin da retina Vasculature

1. Cuidadosamente remover / deitar fora metanol e lavar cuidadosamente as retinas brevemente em PBS (nesta fase a retina ainda está no mesmo tubo de 2 ml a partir da etapa 11).
2. Remover PBS e tampa retinas com 100 ul de solução de Perm / Bloco (PBS + 0,3% Triton + BSA a 0,2%) + 5% de soro apropriado (ver Tabela 1) e agitar suavemente durante 1 hora.
3. Remover Perm / Bloco retinas e incubar com agitação suave durante a noite a 4 ° C com 100 ul de anticorpos primários seleccionados (ver Tabela 1) e / ou IsolectinB4, todas preparadas por diluição em Perm / bloco.
4. Remover anticorpo / isolectin retinas e lavar 4 x 10 min em PBS + 0,3% de Triton (PBSTX).
5. Em alguns casos, por exemplo, a seguir a coloração com IsolectinB4-Alexa488 ou a um anticorpo primário directamente conjugados com um anticorpo secundário não é necessária e as retinas podem ser montados directamente (passo 7). Quando um anticorpo primário não conjugado tenha sido utilizado no passo 3, em seguida 100 ul da adequado fluorescent anticorpo secundário (diluição 1/200 em PBSTX) é adicionado e deixado a incubar durante a noite a 4 ° C ou durante 4 horas à temperatura ambiente.
6. Remover o anticorpo secundário e lava-se as retinas de 4 x 15 min em 2 ml de PBSTX.
7. Transferir retinas em lâminas utilizando uma grande furo pipeta de Pasteur de plástico e remover o excesso de tecido absorvente com PBSTX. Mount retinas pela adição de 50 mL de prolongar montagem sobre uma lamela e posição suavemente sobre a retina.
8. Transferir lâminas para frigorífico durante a noite a 4 ° C, assegurando que são planas e protegida da luz, para permitir a montagem prolongar para definir.
9. Retina de imagem usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência.

Resultados

Após a dissecção da retina deve ser semelhante a uma flor plana (Figura 1). Usando o protocolo descrito acima, as células endoteliais podem ser vistas por meio da coloração B4-Alexa488 isolectin e apoiando células musculares vasculares são visualizadas através de actina do músculo liso anti-alfa (Figura 2). O ponto de vista de baixa potência usando uma objetiva de 5X na Figura 2 permite uma visão geral da organização vascular da retina. Além disso, usando uma combinação...

Discussão

O método aqui apresentado oferece uma maneira simples e eficaz para obter imagens das preparações de montagem de retinas inteiras coradas neonatais de rato, tornando-se um modelo facilmente quantificáveis ​​e fisiologicamente relevante da angiogénese. Inicialmente, o olho do rato pode ser bastante difícil para dissecar devido ao seu pequeno tamanho e forma do globo, então um pouco de prática e boas ferramentas de dissecação são necessários para obter resultados confiáveis. Dissecação de olhos preparado na concentração 2...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material
Pipetas de plástico 3 ml	Suprimentos de Laboratório Científico	PIP4210	Remova a ponta com uma tesoura para criar um furo largo
Placas BD Falcon de 24 poços	Suprimentos de Laboratório Científico	353226
Placas de Petri selecionadas TV 90 mm	Suprimentos de Laboratório Científico	SLS2002
lâminas Histobond	VWR	631-0624
Lamínulas 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Pinças #5	World precision instruments	14095
Tesoura de mola de 10,5 cm de comprimento, com lâminas retas de 8 mm World	precision instruments	501235	Utilizada para enucleação
Tesoura Vannas de 8,5 cm de comprimento, com lâminas retas de 7 mm e pontas superfinas de 0,025 x 0,015 mm	Instrumentos de precisão mundiais	500086	Usado para dissecar retina
Tesouras vannas superfinas de 8 cm de comprimento com lâminas retas de 3 mm, e pontas superfinas de 0,015 x 0,015 mm Instrumentos de	precisão mundiais	501778	Usado para dissecar
retina cristalina’ tubos	2 ml Starlab	E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibásico	Sigma	S0876	PBS reagente
Fosfato de potássio monobásico	Sigma	P5655	PBS reagente
Cloreto de sódio	Sigma	S9625	PBS reagente
Paraformaldeído	Sigma	P6148	Maquiagem em 2x PBS e armazene em -20 ° C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Soro de burro	Sigma	D9663
Soro de cabra	Vector	S-1000
Prolong Gold reagente anti-desbotamento	Invitrogen	P36930	Reagente de montagem
Isolectina GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Use em Diluição 1:200
Isolectina GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Use na diluição 1:200
Anticorpos primáriosAnti-NG2 (policlonal de coelho)Millipore AB5320 Detecta pericitos Anti-GFAP (clone GA5, monoclonal de camundongo)Millipore MAB360 Detecta astrócitos Anti-Desmin (clone Y66,
coelho monoclonal)	Millipore	04-585	Detecta pericitos
Anti-Colágeno IV (coelho policlonal)	Chemicon	AB756P	Detecta membrana basal vascular
Anti-alfa músculo liso actina-Cy3 (clone 1A4, monoclonal de camundongo)	Sigma	C6198	Detecta células musculares lisas vasculares.
Anti-Endoglina (clone MJ7/18, monoclonal de rato)	BD Pharmingen	550546	Detecta células endoteliais
Anti-CD31 (clone MEC13.3, monoclonal de rato)	BD Pharmingen	553370	Detecta células endoteliais
Anti-VE-Caderina (clone 11D4.1, monoclonal de rato)	BD Pharmingen	550548	Detecta junções de células endoteliais
Anti-Alk1 (policlonal de cabra)	R& D Systems	AF770	Detecta células
Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 °C.
Cabra anti-rato-Alexa488	Invitrogen	A11006	Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 °C.
Cabra anti-rato-Alexa594	Invitrogen	A11007	Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 °C.
Anti-camundongo de cabra-Alexa488	Invitrogen	A11029	Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 °C.
Asno anti-cabra-Alexa594	Invitrogen	A11058	Todos os anticorpos secundários são aliquotados imediatamente na chegada e armazenados a -20 °C.
Microscópios
Microscópio de dissecção	Câmera Zeiss	Stemi SV6
Câmera	Zeiss	Axiocam HRc	para microscópio de dissecação
Microscópio Epifluorescente	Zeiss	Axioimager com câmera Apotome
	Câmera Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager
	Nikon	A1R

endoteliais para microscópio confocal