Artigo de método

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

DOI:

10.3791/50597

⸱

6 de agosto de 2013

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1Department of Systems Biology, Sandia National Laboratories, 2Department of Biotechnology and Bioengineering, Sandia National Laboratories, 3Canon U.S. Life Sciences, 4Department of Advanced Systems Engineering and Deployment, Sandia National Laboratories

Neste artigo

Resumo

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Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados ​​para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.

Resumo

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Estudo de células em cultura (análise in vitro) forneceu importantes insights sobre sistemas biológicos complexos. Os métodos convencionais e equipamentos para a análise in vitro são bem adequados ao estudo de um grande número de células (≥ 10 5) em volumes mililitro escala ≥ (0,1 ml). No entanto, há muitos casos em que é necessário ou desejável reduzir a dimensão de tamanho para reduzir o consumo de cultura das células de interesse e / ou os reagentes necessários para a sua cultura, a estimulação ou processamento. Infelizmente, as abordagens convencionais não suportam manipulação precisa e reprodutível de culturas micro-escala, e os sistemas automatizados baseados em microfluídica atualmente disponíveis são muito complexos e especializados para uso de rotina pela maioria dos laboratórios. Para resolver este problema, foram desenvolvidos uma plataforma de tecnologia simples e versátil para a cultura automatizado, estimulação e recuperação de pequenas populações de células (100 - 2000 células) no volume de micro-escalas (1 - 20 ul). A plataforma é constituído por um conjunto de microcapilares revestidos com fibronectina ("câmaras de perfusão de células"), no qual as culturas de micro-escala são estabelecidos, mantida e estimulada, um dispositivo digital de microfluidos (DMF) equipado com "transfer" microcapilares ("hub central "), que as células e reagentes rotas de e para as câmaras de perfusão, uma bomba de seringa de alta precisão, que o transporte de materiais de poderes entre as câmaras de perfusão eo hub central, e uma interface eletrônica que fornece controle sobre o transporte de materiais, o que é coordenado e automatizados via pré-determinados scripts. Como um exemplo, utilizou-se a plataforma para facilitar o estudo de respostas eliciadas transcrição em células imunes ao desafio com bactérias. A utilização da plataforma permitiu-nos a reduzir o consumo de células e reagentes, minimizar a variabilidade experiência para experiência e reorientar as mãos sobre o trabalho. Dadas as vantagens que ela confere, assim como a sua acessibilidade e versatilidade, oplataforma ur deve encontrar o uso em uma ampla variedade de laboratórios e aplicações, e revelar-se especialmente útil para facilitar a análise de células e os estímulos que estão disponíveis apenas em quantidades limitadas.

Introdução

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O estudo de células mantidas em cultura (análise in vitro) forneceu uma visão valiosa sobre os princípios fundamentais e os mecanismos moleculares que regem os sistemas biológicos complexos ea saúde humana. Os métodos convencionais de cultura, estimulação e coleta de células para análise, que utilizam placas de Petri e placas de poliestireno, foram projetados para o estudo de grandes populações de células (≥ 10 5) em volumes de cultura mililitro escala (≥ 0,1 ml). No entanto, há muitos casos em que apenas quantidades limitadas de células estão disponíveis (por exemplo, as células primárias), ou de pequenas populações de células são desejáveis ​​(por exemplo, para reduzir a variabilidade de-célula através da população), ou os reagentes necessários são de difícil obtenção ou proibitivamente caro (por exemplo, células purificadas fatores secretados). Tais questões podem ser abordadas com sucesso pelo redimensionamento tamanho cultura, que tem a vantagem de reduzir o consumo de todos osOs reagentes necessários para a análise in vitro, em 1,2. Infelizmente, equipamentos e métodos convencionais não suportam manipulação precisa e reprodutível de culturas micro-escala e os sistemas automatizados baseados em microfluídica atualmente disponíveis 3-11 são muito complexas e especializadas para uso de rotina pela maioria dos laboratórios.

Neste relatório, nós descrevemos a montagem e utilização de uma plataforma de tecnologia simples e versátil para a cultura automatizada, estimulação e recuperação de pequenas populações de células (100 - 2000 células) em volumes micro-escala (1-20 mL). A arquitetura da plataforma (Figura 1) é um projeto modular: um conjunto de fibronectina revestido microcapilares ("câmaras de perfusão de células" Módulo), que serve como local para o estabelecimento, manutenção e estimulação das culturas micro-escala, e uma microfluídica digital (DMF ) 12,13 dispositivo equipado com "transfer" microcapilares (módulo central "hub") 14,15 células rotase reagentes de e para as câmaras de perfusão. DMF permite ao usuário resolver individualmente várias gotas em simultâneo e de alterar ou re-ordenar as manipulações (ou seja, os trens de processamento de amostras reconfigurar) sem alterar o hardware do dispositivo. A sua grande flexibilidade é evidente em seu surgimento recente como uma tecnologia chave numa vasta gama de aplicações, incluindo a cultura da célula 16,17 18,19 ensaios enzimáticos, os imunoensaios 20,21, 22,23 A análise do DNA, o processamento de proteínas, 24,25 e processamento de amostras clínicas. 26,27 Nossa cubo central aproveita a flexibilidade inerente aos dispositivos de DMF, e aumenta ainda mais através da adição de interfaces de microcapilares, que proporciona oportunidade para a realização de um subconjunto de manipulações (por exemplo, cultura de células) em periférico especializado módulos, em vez de no próprio dispositivo de DMF. A compartimentalização dos comboios de processamento deste modo também simplifica a concepção do plaarquitetura TForm (não é necessário para construir um dispositivo DMF que pode realizar todas as etapas de processamento) e facilita a sua evolução à medida que novas funções são necessárias (simplesmente integrar novos módulos periféricos como necessário). Transporte de células e reagentes dentro do cubo central é accionado por electrowetting forças geradas pela activação sequencial dos eléctrodos no interior do dispositivo de DMF 13,28; transporte para, de e no interior das câmaras de perfusão é alimentado por alterações de pressão geradas por uma seringa de alta precisão bomba. Todos esses movimentos fluidos são controlados através de uma interface eletrônica simples e automatizado através da utilização de pré-determinados scripts.

Como um exemplo representativo, que demonstram a utilização da plataforma para o estudo das respostas da transcrição induzida em células do sistema imune após o desafio com bactérias (Figura 2). Realizar esses experimentos na plataforma nos permitiu trabalhar com um pequeno número de células (~ 1.000 por experimentaçãotal condição), para minimizar a variabilidade experiência-to-experimento, reagentes conservar e re-direta hands-on de trabalho. Dadas as vantagens que ela confere, assim como a sua acessibilidade e versatilidade, esta plataforma deve encontrar utilização numa ampla variedade de aplicações e de laboratórios e ser especialmente útil para facilitar a análise de células e os estímulos que estão disponíveis em quantidades limitadas.

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Protocolo

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Este protocolo geral é concebida para suportar a aplicação da plataforma para uma ampla variedade de estudos, aspectos específicos do estudo representativo descrito neste relatório são separados em suportes Figura 2 ilustra um estudo representativo realizado utilizando o protocolo.. Note-se que no protocolo, todos os "instruir" os comandos são automatizados através do uso de pré-determinados scripts. Note também que o Passo 2 pode ser efectuado em paralelo com o Passo 1 (por exemplo, durante os Passos 1.7 e 1.8), e que é muitas vezes Passo 2.1 contornado (porque as placas do dispositivo modelado DMF / revestido pode ser lavado e reutilizado, ver Passo 5.2) .

1. Montar e preencher as Câmaras de Perfusão celulares

  1. Revestir as superfícies interiores das esterilizado (autoclavado) microcapilares (sílica fundida; od 679 uM, 534 uM ID; 15 cm de comprimento), com a fibronectina, por instruir a bomba de seringa para estabelecer uma solução estéril de fibronectina (30 ul de 50 ug / ml) em cadamicrocapilar, incubação (37 ° C durante 2 horas), instruindo a bomba de seringa para retirar a solução, e deixando o microcapilares seco (temperatura ambiente (RT), durante 6 h).
  2. Conecte cada fibronectina revestido microcapilar (câmara de perfusão) para tubos de policarbonato (500 mM od, ID 100 mm) e da tubulação para a bomba de seringa multi-porta, usando acessórios CapTite (6 câmaras de perfusão, de 8 portas bomba de seringa).
  3. Utilizando fita, proteger o corpo de cada câmara de perfusão para um bloco de aquecimento até à temperatura definida desejada (37 ° C).
  4. Mergulhar as extremidades abertas das câmaras de perfusão em um reservatório (microcentifuge tubo ou placa de microtitulação) células contendo P388D.1 (macrófagos murinos) suspensas em meio de crescimento fresco (RPMI-1640, 10% FBS, 500 unidades / ml de penicilina, 500 ug / mL de estreptomicina) a concentração desejada (10 6 células / ml).
  5. Instruir a bomba de seringa para extrair células (10 uL, 10 4 culas) em cada câmara de perfusão seguido por ai suficienter para mover o tampão líquido (~ 4,5 cm) para a secção fixada ao bloco de calor.
  6. Permitir que as células a aderir às superfícies internas revestidas com fibronectina das câmaras de perfusão (37 ° C durante 1 - 2 h). Ao mesmo tempo, transferir as extremidades abertas das câmaras de perfusão a partir do reservatório de células para um novo reservatório contendo meio de crescimento fresco.
  7. Após o período de adesão, instruir a bomba de seringa para enviar as fichas líquidos (meios condicionados e células acopladas) para o lixo, retirar meio fresco (10 ml), e seguir com ar suficiente para posicionar os novos plugues líquidos (meio fresco) sobre o aderido células.
  8. Continuar a realizar trocas médio (ou seja, repita o Passo 1.7) em intervalos regulares (a cada 2 horas) até as populações de células são suficientemente equilibrada e expandido (16 - 24 horas de micro-escala da cultura de populações gerados ~ 1.000 células / Câmara).

2. Fabricar o dispositivo de DMF e montar o Hub Architecture

  1. Conforme descrito anteriormente 14,29, padrão da placa inferior do dispositivo DMF com quarenta e seis óxido de índio e estanho (ITO) eletrodos (condutores de gotículas de atuação) por fotolitografia e corrosão, e casaco com 5 mm de Parylene-C e 50 nm de Teflon AF. Forma da placa de topo do dispositivo de DMF por revestimento de um substrato de vidro ITO unpatterned com Teflon AF, como acima.
  2. Uso de quadros de metal de compressão, fixar as placas de DMF em um molde de polímero 14,30 com recessos que mantêm o espaçamento de 400 um entre as chapas, o espaçamento, combinada com o tamanho do eléctrodo de accionamento (2,5 mm 2), define o volume de gotas (2,5 ul por eletrodo). Note-se que a montagem de DMF pode ser conseguida por meios mais simples 24.
  3. Inserir revestida de Teflon transferência microcapilares (360 mM OD, 100 uM ID; 3,5-4,0 cm de comprimento) para o espaço entre as placas de DMF, posicionando cada um para o rebordo do seu eléctrodo de accionamento cognato.
  4. Para o en opostod de cada transferência apor microcapilar um encaixe CapTite.
  5. Envolver os conectores elétricos para tensão de alimentação para os eletrodos de ITO. Seqüências de ativação de eletrodos são automatizados através do uso de uma interface eletrônica controlada por computador funcionando pré-determinados scripts.
  6. Opcional: Mova o hub DMF montada no palco de translação de um microscópio (SZ-6145TR (Olympus, Japão)) equipado com um dispositivo de carga acoplada (CCD) da câmera (DCR-HC96 (Sony, Japão)) para facilitar o rastreamento de gotículas 31.

3. Ligue as câmaras de perfusão para o Hub DMF e estimular a populações de células

  1. Remover as extremidades abertas das câmaras de perfusão do reservatório de meio (ver Passo 1.6) e inseri-los nos encaixes CapTite apostos nas extremidades da transferência microcapilares do cubo DMF (ver Passo 2.4).
  2. Instrua a bomba de seringa para enviar as fichas líquidos (meios condicionados) nas câmaras de perfusão para o lixo.
  3. Instruct o cubo DMF para desenhar estímulo (E. coli biopartículas a 100 ug / ml em meio fresco com 0,1% de Pluronic F127 w / v) a partir de um reservatório de bordo e proporcionar uma gota de dimensão adequada (10 ul) para cada transferência microcapilar . Os reservatórios de bordo são constituídos por compartimentos em forma cilíndrica (1,5 x 1,5 cm cada) e ligado ao cubo por meio da tubagem de DMF.
  4. Instruir a bomba de seringa para extrair o estímulo conecta à transferência de microcapilares, e seguir com ar suficiente para posicionar os tampões sobre as populações de células nas câmaras de perfusão.
  5. Incubar as células com estímulo (37 ° C durante 1-4 horas). Opcional: Troca de estímulo fresco (ou seja, repita os passos 3,2-3,4) em intervalos regulares.

4. Terminar Estimulação e recuperar lisados ​​celulares para Análise

  1. Opcional: Se é necessário um período de pós-estimulação, trocar as fichas contendo estímulo líquido por meio fresco (ou seja, repita os passos 3,2-30,4, substituindo meio fresco para o estímulo), e continuar a incubar e trocar, se necessário.
  2. Troca as fichas líquidos nas câmaras de perfusão para tampão de lavagem (Prelude Lise direto Módulo tampão B) (ou seja, repita os passos 3,2-3,4, substituindo o tampão de lavagem de estímulo), e incubar conforme necessário (5 min).
  3. Troca as fichas líquidos (tampão de lavagem) para a solução de lise (Prelude direto Lise módulo A, com 0,1% Pluronic F127 w / v) (ou seja, repita os passos 3,2-3,4, substituindo solução de lise de estímulo), e incubar conforme necessário (5 min) .
  4. Instruir a bomba de seringa para enviar os tampões líquidos (lisados ​​de células) para o centro de DMF.
  5. Desmontar o cubo DMF, remover a placa de topo do dispositivo de DMF (tomando cuidado para não inclinar a placa de lado, como o que pode resultar em gotículas de mistura), e recolher os lisados ​​usando um Pipetman ou seringa para análise off-plataforma (perfil de expressão do gene através qPCR).

5. Limpo Plataforma de Hardware paraRe-use

  1. Imergir a transferência microcapilares e acessórios CapTite em lixívia a 10% (v / v em água) durante 10 min à TA, lave bem com água desionizada, e seco usando gás azoto.
  2. Mergulhar as placas do dispositivo de DMF em lixívia a 10% durante 10 min à RT, enxaguar bem com isopropanol e depois com água desionizada, e utilizando gás de azoto seco, seguido por cozedura a 160 ° C durante 10 min.
  3. Policarbonato tubulação da bomba de seringa, e elenco polímero do dispositivo DMF e quadro de compressão, pode ser reutilizado sem limpeza. A câmara de perfusão microcapilares são descartados após cada experimento.

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Resultados

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Como uma demonstração da plataforma automatizada, que utilizado para levar a cabo um estudo em que as pequenas populações de células imunitárias foram cultivados em culturas em micro-escala, desafiado com bactérias, e lisadas para análise off-plataforma de respostas pró-inflamatórias (Figura 2 ).

Cada uma das seis câmaras de perfusão de células foi semeada com 10 4 P388D.1 células imunitárias (macrófagos murinos) foram ressuspensas em 10 ul de meio de crescimento....

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Discussão

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Nós desenvolvemos uma plataforma automatizada simples e versátil para a cultura de células micro-escala e experiências de estimulação. A plataforma permite-nos trabalhar com pequenos volumes de cultura e populações celulares (1-20 mL e 100 - 2000 células, por câmara); tamanhos cultura pode ser ainda mais reduzida com o uso de microcapilares de menor diâmetro. Trabalhando em ambas as escalas reduz o custo de estudos de rotina e faz estudos viáveis, que requerem o uso de reagentes preciosos e / ou de células. Exp...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem Ronald F. Renzi e Michael S. Bartsch por suas contribuições para a concepção e desenvolvimento de dispositivos de DMF eo hub DMF. Esta pesquisa foi totalmente suportado pelo Laboratório Direção de Pesquisa e Programa de Desenvolvimento do Sandia National Laboratories. Sandia é um laboratório multi-programa gerenciado e operado pela Sandia Corporation, uma subsidiária integral da Lockheed Martin Corporation, para o Departamento de Administração de Segurança Nacional de Energia Nuclear dos EUA sob contrato DE-AC04-94AL85000.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Módulo de Lise Direta PreludeNuGEN1400-24
Trypan Blue (0,4% p/v)GIBCO15250-061
Cell StripperCellgro25-056-C1
Ovation PicoSL WTANuGEN3310-048
Agencourt RNAClean XPBeckman Coulter GenomicsA63987
pHrodo BioParticlesEnsaio InvitrogenP35361
CCL4 TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm00443111_m1
CCL5 Ensaio TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm01302428_m1
PTGS2 Ensaio TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm00478374_m1
TNF Ensaio TaqMan qRT-PCRApplied BiosystemsMm00443258_m1
GAPDH O ensaio de TaqMan qRT-PCRaplicou BiosystemsMm99999915_g1
Pluronic F127Sigma Chemical2594628
Fluorinert FC-40Sigma Chemical51142-49-5
Parylene C dímeroSpecialty Coating Systems28804-46-8
Teflon-AFDuPontAF1600
Polyimide tapeULINES-11928
Substratos de vidro revestidos com óxido de índio e estanho (ITO) Delta TechnologiesCB-40IN-1107
Hub DMF Microcapilares de sílica fundida revestidos com teflonPolymicro Technologies TSU100375
Microcapilares da câmara de perfusãoPolymicro Technologies TSP530700
Tubos e conexões microcapilaresSandia National Laboratories
Tubo de policarbonatoParadigm OpticsCTPC100-500-5
Bomba de seringa de precisão de 8 portas equipada com 30 mm (500 μ l) seringasHamilton Company54848-01
Instrumento de deposição de vapor Parylene-CSistemas de revestimento especiaisPDS 2010 Labcoter 2
Gerador de função de alta tensãoTrek615A-1 615-3
MVX10 microscópioOlympusOpcional (facilita o rastreamento de gotículas no hub DMF)
Câmera digital CCD QIClickQImagingQIClick-F-CLR-12Opcional (facilita o rastreamento de gotículas no hub DMF)

Referências

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Micro scale Cell CultureDigital MicrofluidicsCell Perfusion ChambersSyringe Pump ControlAutomated Cell StimulationQuantitative RT PCR AnalysisFibronectin CoatingMicrocapillary TransportCell Lysate RecoveryImmune Cell Stimulation

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