Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Resumo

Biocompatíveis pH responsivos nanosensors sol-gel pode ser incorporado em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun. Os andaimes de auto-relato produzidos podem ser utilizados para a monitorização in situ de condições micro-ambientais, enquanto a cultura de células sobre o andaime. Isto é benéfico porque a construção celular 3D pode ser monitorado em tempo real, sem perturbar o experimento.

Resumo

Células de cultivo em 3D no andaimes apropriados é pensado para melhor imitar o vivo microambiente e aumentar as interações célula-célula. A construção celular 3D, resultando muitas vezes pode ser mais relevante para estudar os eventos moleculares e interações célula-célula que experimentos semelhantes estudados em 2D. Para criar culturas 3D eficazes com alta viabilidade celular ao longo do andaime as condições de cultura, tais como o oxigénio e necessidade de pH deve ser cuidadosamente controlada de gradientes de concentração do analito pode existir em todo o construto 3D. Descrevemos aqui os métodos de preparação de pH responsivos nanosensors sol-gel biocompatíveis e a sua incorporação em poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) andaimes electrospun juntamente com a sua preparação posterior para a cultura de células de mamíferos. Os andaimes de pH reagir podem ser utilizados como ferramentas para determinar microambiental pH dentro de uma construção celular 3D. Além disso, detalhamos a entrega de pH nanose responsivonsors para o ambiente intracelular de células de mamíferos, cujo crescimento foi suportado por suportes de PLGA electrospun. A localização citoplasmática do pH nanosensors responsivo pode ser utilizado para monitorar o pH intracelular (pHi) durante a experimentação contínua.

Introdução

Uma estratégia chave na engenharia de tecidos é o uso de materiais biocompatíveis para o fabrico de andaimes, cuja morfologia se assemelha ao tecido que vai substituir e também é capaz de suportar o crescimento e função das células ^{de 1,2.} O andaime proporciona suporte mecânico permitindo adesão e proliferação de células ainda permite a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D. O andaime também deve permitir o transporte de massa de nutrientes celulares e não inibir a remoção de resíduos metabólicos ^3.

Eletrofiação emergiu como um método promissor para a fabricação de suportes poliméricos capazes de suportar o crescimento celular ^4-6. As fibras não tecidas electrospun produzidos são adequados para o crescimento celular, como eles são muitas vezes poroso e permitir a interacção célula-célula, assim como a migração de células ao longo dos interstícios de uma construção celular 3D ^7. É importante monitorar a viabilidade celular durante tele período de cultura e para assegurar que a viabilidade celular é mantido ao longo de todo o construto 3D. Por exemplo, as condições de cultura, tais como o oxigénio e requerem um controlo cuidadoso do pH, como os gradientes de concentração do analito pode existir dentro da construção 3D. Ou sistemas de biorreactores de perfusão podem ser empregues para mimetizar as condições in vivo de fluxo intersticial e, como um resultado de transferência de aumento de nutrientes e remoção de resíduos metabólicos ^8. A questão de saber se tais sistemas estão garantindo condições do microambiente constantes podem ser abordadas por meio da avaliação do microambiente celular em tempo real.

Microambiente métricas-chave que poderiam ser monitorados em tempo real incluem: temperatura, composição química dos meios de comunicação de células, a concentração de oxigênio dissolvido e dióxido de carbono, pH e umidade. Dessas métricas, a temperatura pode ser mais facilmente controlada por meio de sondas in situ. Os métodos para monitorar os restantes métricas listadas comumente emvolve a remoção de uma aliquota para a amostragem e, por conseguinte, perturbar a cultura de células e aumentam o risco de contaminação. , Métodos contínua em tempo real estão sendo procurados. Métodos de monitoramento atuais geralmente dependem de instrumentos que verificam fisicamente a construção celular, como um monitor ou sonda pH oxigênio. No entanto, estes métodos invasivos podem danificar a construção celular e perturbar a experiência em curso. Monitoramento não invasivo de concentrações de analito dentro da construção 3D poderia permitir o monitoramento em tempo real de vários aspectos ambientais, tais como esgotamento de nutrientes ^9. Isso permitiria que a avaliação de fornecimento de nutrientes para as regiões mais profundas na estrutura e determinar se os resíduos metabólicos estava sendo removido de forma eficaz ^10,11. Os sistemas que tentam resolver o problema da capacidade de invasão envolvem geralmente a utilização de uma câmara de perfusão que passa através do meio de cultura, tanto o vaso de cultura e para sensores externos, para monitorar o pH, o oxigénio e glicose, ^12. ORe é um interesse crescente no desenvolvimento de sensores que podem ser directamente integrados no vaso de cultura, que não exigem a remoção de uma aliquota para a amostragem e, como tal, poderia prever na monitorização in situ.

Para lidar com essas deficiências para in situ e monitoramento não invasivo das condições do microambiente que incorporaram analitos nanosensors responsivos em andaimes electrospun para produzir auto-relato andaimes ^13. Os andaimes que actuam como dispositivos de detecção por monitorização da actividade de fluorescência foram preparados anteriormente, em que o dispositivo de detecção era ou o andaime polimérico real criado por electrospinning, ou através do uso de um corante sensível analito que é incorporada no polímero antes da formação do andaime ^14,15 . No entanto, estes dispositivos sensores têm o potencial para se obter saídas ópticas erróneos causados ​​pela possível interferência de outros analitos. O uso de um dispositivo de detecção de medida proporcional such como os que são preparados no protocolo descrito tem o potencial de eliminar estes efeitos adversos possíveis e fornecer uma resposta específica para o analito em questão.

Os andaimes electrospun aqui apresentados foram preparados a partir da poli-co-polímero sintético (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), escolhido devido a ter a Food and Drug Administration aprovação (FDA), devido às suas propriedades biodegradáveis ​​e biocompatíveis e uma faixa ficha de suporte do crescimento e função de vários tipos de células ^16-18. Os analitos raciométrica nanosensors responsivos preparados são sensíveis ao pH. Os nanosensors incorporar dois corantes fluorescentes numa matriz de sol-gel biocompatível, onde um corante, FAM é sensível ao pH e o outro, TAMRA actua como um padrão interno, uma vez que não é sensível ao pH. Além disso, a fluorescência de ambos FAM e TAMRA podem ser analisados ​​separadamente uma vez que não se sobrepõem. A determinação da relação da emi fluorescênciassion de ambos os corantes em comprimentos de onda específicos dá uma resposta independente do pH de outras condições ambientais. Os andaimes de auto-relato pode permitir a avaliação da repetição do pH in situ e em tempo real, sem perturbar o modelo 3D desenvolvido. Demonstrou-se que estes suportes são capazes de suportar fixação e proliferação celular e permanecer sensível ao analito em questão. A cinética de ácido subprodutos em construções projetadas permanece pouco estudado e, como tal, utilizando o pH andaimes responsivos poderia facilitar muito os estudos ^19. Além disso, o uso dos andaimes de auto-relato para aplicações em engenharia de tecidos apresenta a oportunidade de compreender, monitorar e otimizar o crescimento do modelo 3D construções de tecidos in vitro, de forma não invasiva e em tempo real.

Os pH nanosensors responsivos também foram entregues para o meio intracelular de fibroblastos cultivados sobre electrospun scaffol PLGAds. A proporção da emissão de fluorescência a partir dos corantes foram utilizados para monitorizar o pHi e comparado com um auto-relato de andaime integrem nanosensors pH. A entrega de nanosensores para as células cultivadas em um ambiente 3D poderia permitir o monitoramento da concentração de analito de profundidade dentro da construção de uma forma não destrutiva. Portanto nanosensors pode ser uma ferramenta de imagem viável para avaliar o comportamento das células de modo não destrutivo ao longo 3D constrói permitindo a análise de longo prazo. Rastreio a concentração do analito de células individuais dentro de uma construção em 3D poderia garantir que eles estão recebendo as concentrações de nutrientes e oxigênio suficientes. Parâmetros do processo de acompanhamento pode ajudar no desenvolvimento de técnicas padronizadas para o transporte de massa eficiente de oxigênio e nutrientes. A entrega de nanosensores para o meio intracelular e incorporação de nano-sensores em scaffolds poliméricos podem ser combinadas para permitir a avaliação da viabilidade das células, bem como o desempenho de andaime dentro de const 3Dructs durante o processo de crescimento do tecido. Isso pode levar a um maior conhecimento dessas construções e progredir a fabricação de substitutos de tecido biologicamente relevantes.

Protocolo

Visão global

Secção 1 descreve a preparação de pH nanosensors reactivos e caracterização da resposta nanosensor para pH usando espectrometria de fluorescência e o seu tamanho usando SEM.

Seção 2 descreve a preparação de suportes poliméricos electrospun e caracterização da sua morfologia e tamanho utilizando SEM. Seção 2 também descreve a preparação de andaimes de auto-relato que são andaimes electrospun com a inclusão dos pH nanosensors responsivos. Os andaimes resultantes de auto-relato são caracterizados por MEV para avaliar se as alterações morfológicas nas fibras electrospun ocorreu. A fluorescência a partir dos suportes de auto-relato resultantes das nanosensors incorporadas é avaliada por microscopia confocal.

A seção 3 descreve a cultura de células em cima do andaime eo andaime electrospun auto-relato. Os andaimes são esterilizados em primeiro preparatíon para cultura celular após o que os andaimes são avaliados para determinar se a esterilização ea cultura de células afetam a capacidade de fluorescência dos andaimes de auto-relato. O protocolo também descreve a entrega de nanosensors de células que são cultivadas sobre andaimes electrospun. Corante Lysotracker é usado para garantir que nanosensors não foram tidas em compartimentos celulares ácidas.

1. Elaboração e análise de pH Responsive Nanosensors sol-gel

1.1 Preparação de pH Responsive Nanosensors sol-gel

Nota: A preparação deve ser realizada numa hote.

1. Preparar os fluoróforos para utilização nas nanosensors pH por dissolução de 5 - (e-6)-carboxifluoresceína, éster de succinimidilo (FAM-SE) (1.5 mg) em dimetilformamida (DMF) (1 ml) em um balão de fundo redondo e 6-carboxitetrametilrodamina fundo , éster de succinimidilo (TAMRA-SE) (1,5 mg) em DMF (1 ml) num outro balão de fundo redondo.Adicionar 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) (1,5 ml) a cada balão e agita-se sob uma atmosfera de azoto seco (21 ° C) durante 24 horas no escuro, ou seja, moldar as amostras em alumínio.
2. Adicionar tanto dos corantes acima (250 uL) a uma mistura de etanol (6 ml) e hidróxido de amónio (30% em peso, 4 ml), contida num balão de fundo redondo e agitou-se durante 1 hora (21 ° C).
3. Lentamente, adicionar tetraetilortossilicato (TEOS) (0,5 ml) à mistura, a continuar com agitação durante mais 2 horas. A mistura vai ficar turva. Os nano-sensores podem ser recolhidos por evaporação rotativa. Nano pode ser armazenado num frasco de vidro a ^{4 °} C para uso futuro.
   
   CUIDADO: subsequente manuseamento da nanosensors na sua forma seca, devem ser realizados em um exaustor ou no caso de pesagem lhes o equilíbrio deve ser colocado, por exemplo, em um Weighsafe.

1.2 nanosensor Resposta ao pH

1. Preparar soluções de tampão fosfato de Sorensen que variam de 5,5-8,0 pH por mixing proporções específicas de fosfato monobásico de sódio (0,2 M) e fosfato de sódio dibásico soluções stock (0,2 M). Verifique o pH final usando um medidor de pH. Faça os ajustes menores ao pH utilizando hidróxido de sódio (NaOH) (4 M) ou ácido clorídrico (HCl) (2 M).
2. Suspender as nanosensors pH nas soluções tampão de pH (5 mg / ml), em primeiro lugar, segurando o recipiente contendo a solução nanosensor num vortex durante 3 minutos e depois da submersão do recipiente num ultrasonicator até a solução se tornar turva (aproximadamente 5 min). Repita essas etapas para suspender totalmente as nanosensors em solução.
3. Colocar a primeira solução a uma cuvete óptico e utilizar comprimentos de onda de excitação de 488 nm para a 5 - (e-6)-carboxifluoresceína (FAM) e 568 nm para a 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA). Recolha os comprimentos de onda de emissão de 500-530 nm para FAM e 558-580 nm para TAMRA usando um espectrômetro de fluorescência.
4. Mudar as soluções na cuvete óptico de modo a que o pH pode ser observada em diferentes pH e continuar collecting os espectros de emissão.
5. Calcula-se a relação entre o máximo de emissão produzido em cada valor de pH para produzir uma curva de calibração.

1.3 SEM de Nanosensors

1. Coloque uma amostra dos nano-sensores em um revestimento de carbono microscópio eletrônico de stub e arranhar o revestimento com ouro por 5 min em atmosfera de árgon.
2. Observar por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Durante o exame ajustar a distância de trabalho, tensão e ampliação para minimizar o carregamento de elétrons (Figura 1).

2. Elaboração e Análise de PLGA Andaimes

2.1 Electrospinning PLGA Andaimes

1. Numa hotte dissolver o poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), em diclorometano (DCM) (20% (w / w)) com formato de piridínio (PF) (1% (w / w)). Coloque a solução numa seringa de 10 ml com uma agulha 18 G romba de enchimento e de forma segura para o ajuste de uma bomba de seringa.
2. Distância da ponta da agulha 20 centímetros de distância de uma 20cm x 15 cm de alumínio placa de coleta.
3. Conecte o eletrodo de uma fonte de alimentação de alta tensão para a ponta da seringa e da terra para a placa de coleta de alumínio.
   
   CUIDADO: Cuidados devem ser tomados como de alta tensão é usado ou seja sempre recorrer a alimentação elétrica antes de manusear qualquer equipamento electrospinning.
4. Entregar a solução com um caudal constante de 3,5 m / h a 12 kV durante 2 horas. Electrospinning usando estas condições darão uma profundidade de andaime de cerca de 60 um.
5. Deixar o andaime numa hote durante 24 horas para permitir resíduo solvente a evaporar.

2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Andaimes

1. Prepare andaimes incorporando pH nanosensors sensíveis como descrito na seção 2.1, mas com a modificação de adicionar nanosensors para a solução de polímero (5 mg / ml). Suspender as nanosensors na solução de PLGA com o auxílio de ultra-sons (cerca de 5 min) antes para colocação numa seringa de 10 mL.

2.3 SEM de PLGA Andaime e pH Scaffold Responsive

1. Coloque uma amostra do andaime PLGA ou pH andaime responsivo em um elétron revestido microscópio esboço de carbono e proceder conforme descrito para MEV de nano-sensores (Figura 1).

2.4 Calibração de pH Scaffold Responsive

1. Coloque uma amostra de pH andaime sensível em uma placa de cultura de 35 mm, e mergulhar em soluções tampão adequadas.
2. Em um microscópio confocal de utilizar um laser de árgon de 488 nm para excitar o FAM e um laser de crípton 568 nm para excitar o TAMRA dentro dos nano-sensores. Observe a emissão de fluorescência para pH andaimes responsivos a 500-530 nm para FAM e 558-580 nm para TAMRA. (Figura 2). Use varredura sequencial para evitar cobrança de comprimentos de onda de excitação.

3. Cultura celular em cima de PLGA Andaimes e pH Responsive PLGA Andaimes

ntent "> Nota: O seguinte deve ser realizada em um gabinete de cultura de células.

3.1 Preparação de PLGA Andaimes para Cultura de Células

1. Corte as PLGA ou pH sensíveis andaimes PLGA em dois centímetros ² peças.
2. Esterilizar andaimes por irradiação com luz ultravioleta (UV), a uma distância de 8 cm durante 15 minutos de cada lado.
3. Transferir os andaimes para uma placa de cultura de 12 poços e colocar um anel de aço na parte superior. Adicionar uma solução de penicilina / estreptomicina (5% v / v) em tampão fosfato salino (PBS) para o interior e exterior do anel de aço, incubar durante a noite (37 ° C, 5% CO _2). Observe o anel de aço foi fabricado na Universidade de Nottingham e tem as seguintes dimensões: diâmetro externo 2 cm, diâmetro interno 1 centímetro, 1 cm de profundidade.
4. Remover a solução de esterilização e lavou-se com PBS.
5. Adicionar meio de cultura de células para o interior (500 ul) e exterior (500 ul) do anel de aço, em lugar de uma incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂ ), enquanto que a preparação de uma suspensão de células.
6. Prepara-se uma suspensão de células e efectuar uma contagem de células utilizando um ensaio de exclusão com Trypan Blue.
7. Criar uma suspensão de células para obter um número de células de 1 x 10 ⁶ células / ml.
8. Remova a mídia de dentro e de fora do anel de aço.
9. Substituir com meio de cultura de células pré-aquecido na parte externa do anel de aço (1 m).
10. Adicionar 300 ul da suspensão de células para o interior do anel de aço - placa de rocha para trás e para a frente suavemente para distribuir células.
11. Coloque a placa de cultura de células em uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ - a fixação das células deveria ter ocorrido no prazo de 24 horas, no entanto continuar a cultura durante o tempo que o experimento exige - refrescante a mídia a cada 2-3 dias.

3.2 nanosensor entrega para as células cultivadas sobre PLGA Scaffold

1. Células semente em PLGA andaime, conforme descrito na seção 3.1. Para este estudo um PLGA andaime em branco (não containanosensors ning) foi usado devido à sobreposição de emissão de fluorescência quando Imaging.
2. Colocar o andaime semeado célula em uma incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 72 horas para permitir que as células crescem e migram ao longo do andaime antes nanosensor entrega.
3. Antes nanosensor entrega (37 ° C, 5% CO ₂₎ lavar as células com PBS e alterar o suporte a partir de meios de cultura padrão para meios livres de soro e antibióticos, incubar durante 1 hora. Nota: os meios de cultura padrão para células 3T3 compreende de meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal de vitelo, a solução de ((v / v) a 10%), L-glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (1% (v / v)) .
4. Durante o período de incubação de preparar o complexo de lipossoma-nanosensor por sonicação breve nanosensors (5 mg) com Optimem (50 uL) para criar a solução A.
5. Criar solução B por adição de Lipofectamine 2000 (5 ul) para Optimem (45 ul), incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
6. Adicionar soluçãoA à solução B, incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para formar a solução C, que é o complexo nanosensor-lipossoma.
7. Adicionar a solução C (100 ul) a células e incuba-se (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante 3 horas.
8. Remover os andaimes semeados células da incubadora, os meios aspirados e lavar duas vezes com PBS antes da adição de PBS (1 ml) para permitir a visualização de células vivas por microscopia confocal. Nota: O PBS foi utilizado neste protocolo de modo a que o indicador de vermelho de fenol presente em meios de cultura de células não causar autofluorescência e também porque a calibração em diferentes pH estava a ser executada. No entanto meio isento de vermelho de fenol pode ser utilizado para a análise de mais longo prazo de culturas de células.
9. Mergulha-se o andaime semeado célula em tampões de pH diferente e monitorizar a resposta das nanosensors associados com as células.
10. Monitorizar o pHi por determinação da relação entre as intensidades de fluorescência de FAM e TAMRA pela observação de fluorescência usando microscopia confocal (Figure 3).

3.3 nanosensor Localização dentro de células de mamíferos

1. Incubar as células com nanosensors contendo apenas o corante FAM como descrito na secção 3.2 (isto é, porque a emissão de fluorescência de TAMRA é na mesma região espectral como a Lyso Tracker vermelho). Preparar estas nanosensors como descrito na seção 1.1, mas com a omissão de preparar e adicionando TAMRA.
2. Após o período de entrega nanosensor diluir solução estoque Lyso Tracker Vermelho para 50 nm.
3. Adicionar uma parte alíquota da solução diluída (2 mL) para células cultivadas sobre suportes de PLGA.
4. Incubar as células com Lyso Tracker vermelha durante 1 hora (37 ° C, 5% CO _2).
5. Após o período de incubação de remoção dos suportes e lavar as células duas vezes com PBS (pH 7,4) antes de mudar os meios de PBS (pH 7,4) (2 ml), em preparação para a visualização por microscopia confocal. Nota: Fenol meio isento de vermelho pode ser usado em vez de PBS.
6. Adicione o corante nuclear DraQ5 para o PBS até a concentração final ser 5 mM e incuba-se com as células durante 3 minutos (37 ° C, 5% CO _2). Não é necessário mudar os meios de comunicação a seguir ao período de incubação com DRAQ5.
7. Use um laser de 488 nm argônio para excitar o FAM só nanosensors, um laser de criptônio 568 nm para excitar o Lyso Tracker Red e 633 nm do laser de hélio / néon para excitar o cromóforo DRAQ5 e observar fluorescência em 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm, respectivamente (Figura 3). Use varredura sequencial para evitar cobrança de comprimentos de onda de excitação.

Resultados

A distribuição do tamanho das pH nanosensors responsivos preparadas foi caracterizado utilizando SEM, onde a população de nanosensors fotografados foram medidos e verificou-se ter dimensões nanométricas na gama de 240-470 nm (Figura 1A). A realização de um diâmetro estreito e razoavelmente pequeno é consistente com o uso do método de Stöber para preparar nanopartículas. Verificou-se que utilizando um ambiente de pH básico durante a síntese de nanopartículas ou seja nanopartículas preparadas uti...

Discussão

A engenharia de tecidos aspira para criar substitutos biológicos que podem ser utilizados tanto in vivo como in vitro como em modelos de tecido e em terapia de substituição de tecido para substituição, reparação, manter ou melhorar a função de um tecido ou órgão específico. Substitutos sintéticos têm sido usados ​​por muitos anos para substituir ou reparar ajuda de tecidos, mas estes muitas vezes não conseguem devido à falta de integração com o tecido e / ou infecção do hospedeiro, o que acaba...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Etanol	Fisher	32221
Dimetilformamida anidra (DMF)	Sigma	270547
Solução aquosa de hidróxido de amônio 50% (v/v)	Alfa Aesar	35574	diluído a 30% (v/v) com água pura
TEOS	Sigma	13190-3
3-Aminopropiltrietoxissilano (APTES)	Sigma	A3648
5-(e-6)-carboxifluoresceína, éster succinimidílico (FAM-SE)	Invitrogen	C1311
6-carboxitetrametilrodamina, éster succinimidílico (TAMRA-SE)	Invitrogen	C1171
Fosfato de sódio monobásico (0,2 M)	Sigma Aldrich	S-9638
Fosfato de sódio dibásico (0,2 M)	Sigma Aldrich	S-0876
NaOH	Sigma Aldrich	S8045
Tripsina / EDTA	Sigma Aldrich	T4174
Penicilina / Estreptomicina	Sigma Aldrich	P0781
PBS	Sigma Aldrich	D8537
DMEM	Sigma Aldrich	D6046
	FBS Source Bioscience	Batch-213-101992
L-Glutamina	Sigma Aldrich	G7513
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-019
Optimem	Invitrogen	11058-021
LysoTracker Red	Invitrogen	L-7528
Draq5	Biostatus Ltd	DR50050
Gás nitrogênio	BOC
DCM	Sigma Aldrich	320269
TFA	Sigma Aldrich	T6508
Microscópio confocal	Leica TCS-SP		equipado com lasers de argônio e criptônio e uma lente de imersão em água 63X 0.9NA
Luz UV	UVLS28 UVP, EUA
Placa misturadora	SB161-3 Jencons-PLS
Medidor de pH	Jenway modelo 3510
Evaporador rotativo	Buchi Rotary Centrífuga Evaporadora R200
(nanossensores)	Hermle Z300
(cultura de células)	Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo
Vortex	Whirlimixer Fisherbrand
Ultrasonicator	FB11021 Fisherbrand
Folha de alumínio	Universidade de Nottingham
Placa de cultura de células de 35 mm	Iwaki	3000035
seringa de 10 ml	Becton Dickenson
3T3 Células de fibroblastos	Coleção Europeia de Culturas de Células
PLGA	Lakeshore Biomaterials	7525 DLG 7E
Formato de piridínio	Sigma Aldrich	P8535
Azul de tripano	Sigma Aldrich	T8154
Fosfato de sódio monobásico	Sigma Aldrich	S9638
Fosfato de sódio dibásico	Sigma Aldrich	S5136
HCl	Sigma Aldrich	320331