Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

Serene M.L. Lee; Celine Schelcher; Maresa Demmel; Maria Hauner; Wolfgang E. Thasler

doi:10.3791/50615

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Artigo de método

Isolamento de hepatócitos humanos por duas etapas Collagenase Perfusão Procedimento

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DOI:

10.3791/50615

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3 de setembro de 2013

Serene M.L. Lee¹^,² , Celine Schelcher¹ , Maresa Demmel²^,³ , Maria Hauner³ , Wolfgang E. Thasler⁴

¹Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, ²Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, ³Hepacult LLC, Regensburg, ⁴Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

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Resumo

Um procedimento de duas etapas de perfusão de colagenase modificado para isolamento de hepatócitos humanos é descrita. Este método também pode ser aplicado a outros fígados de mamíferos. Os hepatócitos isolados estão disponíveis em alto rendimento e viabilidade, tornando-os um modelo adequado para a investigação científica em áreas como a regeneração do fígado, farmacocinética e toxicologia.

Resumo

O fígado, um órgão com capacidade de regeneração excepcional, realiza uma ampla gama de funções, como a desintoxicação, metabolismo e homeostase. Como tal, os hepatócitos são um modelo importante para uma grande variedade de questões de pesquisa. Em particular, o uso de hepatócitos humanos é especialmente importante nas áreas de farmacocinética, a toxicologia, a regeneração do fígado e investigação de translação. Assim, este método apresenta uma versão modificada de um procedimento de perfusão com colagenase em dois passos para isolar hepatócitos como descrito por Seglen ^1.

Anteriormente, os hepatócitos foram isolados por métodos mecânicos. No entanto, os métodos enzimáticos têm sido mostrados como sendo superior como hepatócitos mantêm a sua integridade estrutural e a função, depois do isolamento. Este método aqui apresentado adapta o método concebido anteriormente para os fígados de ratos aos pedaços de fígado humano e resulta num grande rendimento de hepatócitos com uma viabilidade de 77 ± 10%. A principaldiferença neste processo é o processo de canulação dos vasos sanguíneos. Além disso, o método aqui descrito também pode ser aplicado a partir de fígados de outras espécies com tamanhos do fígado ou dos vasos sanguíneos comparáveis.

Introdução

A suspensão de células de fígado pode ser preparado a partir do fígado por meio de métodos mecânicos ou enzimáticos. Os métodos mecânicos usados para preparar as células do fígado integrais incluem forçando o fígado através de gaze ^2, agitando um pedaço de fígado com contas de vidro em uma coqueteleira Kahn ^3, utilizando homogeneizadores de vidro com pilões soltas ^4,5 etc Ao longo dos anos, os métodos mecânicos caíram fora do favorecem, devido à lesão das membranas das células e a perda da função dos hepatócitos isolados ^6,7. Por conseguinte, a utilização de um método enzimático é actualmente o principal método p....